Untersuchung der Zelltodinduktion durch onkolytische Viren bei Glioblastom-Zelllinien

Abstract

Das Glioblastoma multiforme ist der aggressivste Hirntumor des Menschen. Die derzeitige Therapie sieht eine chirurgische Resektion kombiniert mit einer Radiochemotherapie vor. Dennoch versterben die Patienten im Durchschnitt nach 10 bis 15 Monaten und ein kurativer Therapieansatz, der eine vollständige Tumorregression bewirkt, fehlt. Die nicht humanpathogenen onkolytischen Reo- (RV), Parvo- (PV) und Newcastle-Disease-Viren (NDV) zeichneten sich in der Vergangenheit durch ihre vielversprechende Fähigkeit, selektiv Tumorzellen abtöten zu können, aus. Basierend auf Vorarbeiten und Erkenntnissen aus der Literatur wurde im vorliegenden Dissertationsprojekt die onkolytische Wirksamkeit einer Doppelinfektion im Vergleich zur Einzelinfektion mit onkolytischen Viren (OV) evaluiert, um die Erfolgsaussichten einer kombinierten OV-Therapie abzuschätzen. Dazu wurde die onkolytische Zelltodinduktion charakterisiert. Nach der Produktion der OV und Bestimmung der exakten Virusmenge per real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) wurde die Zytotoxizität im 1-(4,5-Dimethylthiazol-2- yl)-3,5-diphenyl-formazan-(MTT)-Assay nachgewiesen. Anschließend wurde die basale Viruskonzentration für eine onkolytische Wirksamkeit erhoben und eine Dosis- Wirkungskurve bestimmt. Daraufhin wurde das Zellsterben mittels Apoptose und Nekrose anhand der zellulären Hoechst- und Propidiumiodid-Bindung und der Auswertung der Zellmorphologie nachgewiesen. In einer durchflusszytometrischen Untersuchung wurde die Apoptose-, Nekroptose- und Nekroserate über die Expression von Phosphatidylserin und die Detektion von Annexin-V bestimmt. Dabei wurde die Einzelinfektion mit der Doppelinfektion von bis zu zwei Glioblastomzelllinien mit verschiedenen Infektionstitern und Inkubationszeiten verglichen. Zusätzlich wurde die Aktivität der Effektorcaspasen-3/7, einer zellulären Protease des Apoptose-Signalweges, zu verschiedenen Zeitpunkten nach Einzel- und Doppelinfektion ermittelt. Nach Ermittlung einer Dosis-Wirkungskurve und Charakterisierung des Zelltods zeigte sich eine zeit- und konzentrationsabhängige onkolytische Wirksamkeit nach Einzel- und Doppelinfektion. 24h und 48h nach kombinierter Gabe von NDV mit einem weiteren Virus in Zusammenfassung 1 den verwendeten niedrigen (1 und 10 cp/c) Viruskonzentrationen waren die ermittelten Zelltod- Aktivitäten gegenüber denen der NDV-Einzelinfektion nicht erhöht. Die Doppelinfektion mit RV und PV mit hoher Viruskonzentration zeigte eine um 12 % erhöhte onkolytische Wirksamkeit im Vergleich zur jeweiligen Einzelinfektion, die sich auch mit geringfügig erhöhten Aktivitäten der untersuchten Zelltode bestätigten. 72h nach Doppelinfektion der U87 Zellen wurde eine zur Einzelinfektion höhere Zytotoxizität nachgewiesen. Dieser Effekt konnte nach Doppelinfektion der sekundären Glioblastomzelllinie U373 nicht bestätigt werden, sodass zelllinienspezifische Ergebnisse vorlagen. Die RV- und NDV-Einzelinfektionen zeigten eine ausgeprägte onkolytische Wirksamkeit. Nach Doppelinfektion unterschieden sich zeitabhängig die induzierten Zelltode von denen nach Einzelinfektion. Je länger die Inkubationszeit, desto höher waren die Aktivitäten der programmierten Zelltodarten Apoptose und Nekroptose. Nach Doppelinfektion wurde im Zeitverlauf hauptsächlich der Zelltod durch Nekroptose eingeleitet. Allerdings wurden in abnehmender Intensität auch Apoptose und Nekrose verzeichnet. Zudem konnte bereits 4h nach Infektion mit RV, NDV, RV+PV, RV+NDV und PV+NDV eine caspase-abhängige Apoptose-Induktion nachgewiesen werden, die je nach untersuchter Inkubationszeit unterschiedlich ausgeprägt war. Die verwendeten Viruskonzentrationen und der untersuchte Zeitraum zur Charakterisierung der Zelltodarten reichten nicht aus, um eine signifikant vermehrte onkolytische Wirksamkeit und höhere Zelltodaktivitäten nach Doppelinfektion nachzuweisen. Daher sollten die vielversprechenden Beobachtungen zur Zelltodinduktion zukünftig mit einer höheren Viruskonzentration und einer längeren Inkubationszeit wiederholt werden. Dadurch können potenzielle additive Effekte, insbesondere durch den immunogenen Zelltod durch Nekroptose, nach Doppelinfektion aufgedeckt werden.

Glioblastoma multiforme is the most aggressive human brain tumor. Even after undergoing standard therapy, which currently consists of surgical resection and radiochemotherapy, patients die after 10 to 15 months on average. There has yet to be discovered a curative therapeutic approach that achieves complete tumor regression. Oncolytic viruses (OV) that are not pathogenic to humans, such as reovirus (RV), parvovirus (PV), and newcastle Disease virus (NDV), have demonstrated the promising ability to selectively kill tumor cells in the past. Based on previous work and findings from literature, this dissertation project evaluates the oncolytic efficacy of a double infection compared to a single infection with OV in order to assess the chances of success of a combined OV therapy. For this purpose, we characterized cell death induction by OV. We performed 1-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-3,5-diphenyl-formazan-(MTT)-assays to assess cytotoxicity after producing OV and determining the exact amount of virus concentration using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). Following that, the basal virus concentration for oncolytic concentration was measured, and a dose-response curve was determined. Cell death via apoptosis and necrosis was then detected by using cellular Hoechst and propidium iodide staining and by evaluation of the cell morphology. Then, we performed a flow cytometric assay to determine the activity of apoptosis, necroptosis, and necrosis by the expression of phosphatidylserine and detection of annexin-V. Using different infection titers and incubation times, single infection was compared to double infection of up to two glioblastoma cell lines. Furthermore, the activity of effector caspases-3/7, a cellular protease involved in the apoptosis signaling pathway, was measured at multiple time points after single and double infection. After generating the dose-response curve and characterizing cell death, time- and concentration-dependent oncolytic efficacy for single and double infection could be demonstrated. 24h and 48h after combined administration of NDV with another virus at low (1 and 10 cp/c) virus concentrations, the cell death activity observed was not increased compared with a single NDV infection. RV and PV double infection with high virus Zusammenfassung 3 concentration resulted in a 12% increase in oncolytic efficacy compared to the corresponding single infection, which was also backed by slightly increased activities of the investigated cell death modes. Monotherapy with RV and NDV showed substantial oncolytic efficacy Higher cytotoxicity was detected 72 hours after double infection of U87 cells compared to single infection. This effect could not be reproduced after double infection of the secondary glioblastoma cell line U373, indicating that cell line-specific results were obtained. When compared to a single infection, different cell deaths were induced in a time-dependent manner after double infection. The longer the incubation period, the more active the programmed cell death modes via apoptosis and necroptosis were. As time passed after a double infection, cell death was primarily mediated by necroptosis. Apoptosis and necrosis were also detected in low levels. In addition, caspase-dependent apoptosis induction was detected 4h after infection with RV, NDV, RV+PV, RV+NDV, and PV+NDV. The apoptosis activity varied depending on the incubation period examined. The virus concentrations used, and the incubation period studied to characterize the cell death modes were insufficient to demonstrate significantly increased oncolytic efficacy and higher cell death activities after double infection. Future experiments should reproduce the encouraging findings on cell death induction with a higher virus concentration and a more extended incubation period. This could reveal potential additive effects on tumor cell killing through immunogenic cell death by necroptosis after double infection.