Characterization of the transmembrane protein 109 in SRP-independent protein targeting to the human endoplasmic reticulum and its involvement in the cellular calcium homeostasis

Abstract

Protein transport to the endoplasmic reticulum mainly relies on the signal recognition particle pathway. However, in the past decades, novel pathways and modes of protein transport have been identified to complement known transport routes for specific protein substrates to reach the endoplasmic reticulum. The signal recognition particle-independent (SND) pathway was identified in yeast cells as a tripartite system (Snd1-3). It presumably conducts protein clients to the endoplasmic reticulum due to a targeting signal located downstream of the N-terminus. However, the entire pathway has not been identified in human cells, so far. Only one component, the ER membrane protein hSnd2, is known in mammalian cells. This work aimed to identify the missing ER membrane protein, the hSnd3 of the pathway. Previous co-immunoprecipitation and subsequent mass spectrometry results revealed the interacting proteins with the hSnd2. Amongst these proteins, the transmembrane protein 109 (TMEM109) was enlisted, and it also showed simultaneous lower abundance when hSnd2 was knocked down. TMEM109 is a three-transmembrane domain protein resident in the endoplasmic reticulum membrane. A luminescence reporter assay described in this work also confirmed the interaction between the two proteins in living cells. TMEM109 knockdown resulted in the compensatory elevated abundance of the translocon Sec61α subunit and known targeting receptors, such as the signal recognition particle receptor. Accordingly, an improved transport efficiency of signal recognition particle-dependent substrates was observed. These results were consistent and congruent with data obtained when hSnd2 was knocked down. The model protein, cytochrome b5, a tail-anchored membrane protein showed partial dependence on the SND pathway based on in vitro translation assay results; however, re-expressing TMEM109 after its silencing did not rescue its transport efficiency to the endoplasmic reticulum. Using the CRISPR-Cas9 gene-editing system, a TMEM109 knockout cell line was generated. In TMEM109 knockout cells, similar but much more pronounced compensatory effects as in the knockdown cells were observed. Conversely, the partial SND dependence of the tail-anchored membrane protein, cytochrome b5 was not observed in TMEM109 knockout cells, likely due to the activated compensatory mechanisms. TMEM109 has been described as a calcium channel in the endoplasmic reticulum membrane. Live-cell calcium imaging shed light on the fact that lower TMEM109 abundance can disturb the calcium homeostasis; however, it was not observed in the cells completely lacking TMEM109. Based on the obtained results, TMEM109 is possibly implemented in protein targeting to the endoplasmic reticulum as an SND pathway element in human cells. However, no bona fide human SND pathway substrate has been identified so far. Further research would address the subset of proteins that require the SND pathway to transport to the endoplasmic reticulum. It is also possible that the SND pathway complements already known transport pathways, or it is activated under specific cellular circumstances.

Der Proteintransport zum endoplasmatischen Retikulum beruht hauptsächlich auf dem Signalerkennungspartikelweg. In den letzten Jahrzehnten wurden jedoch neue Wege und Arten des Proteintransports identifiziert, die zum endoplasmatischen Retikulum bekannte Transportwege für bestimmte Proteinsubstrate ergänzen oder ersetzen. Der Signalerkennungspartikel-unabhängige (SND) Weg wurde in Hefezellen als Dreikoponentensystem (Snd1-3) identifiziert und leitet aufgrund eines Zielsignals Proteine zu dem endoplasmatischen Retikulum, welches sich vermutlich abseits des N-Terminus befindet. In menschlichen Zellen wurde bisher nicht der gesamte Signalweg identifiziert. Nur eine Komponente, das ER-Membranprotein hSnd2, ist in Säugetierzellen bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war das fehlende ER-Membranprotein, hSnd3 des Weges zu identifizieren. Frühere Co-Immunopräzipitation und anschließende Massenspektrometrie-Ergebnisse zeigten die mit hSnd2 interagierenden Proteine. Es wurde unter anderem das Transmembranprotein 109 (TMEM109) identifiziert, welches zudem eine verringerte Abundanz nach siRNA-vermittelter hSnd2 Depletion aufwies. TMEM109 ist ein Membranprotein des endoplasmatischen Retikulums mit drei Transmembrandomänen. Ein Lumineszenz-Reporter-Assay, der in dieser Arbeit beschrieben wurde, bestätigte ebenfalls die Interaktion zwischen den beiden Proteinen in lebenden Zellen. Der Knockdown von TMEM109 führte zu einer kompensatorisch erhöhten Abundanz der zentralen Translokon-Untereinheit Sec61α und bekannter Targeting-Rezeptoren, wie etwa der Signalerkennungspartikel-Rezeptor. Dementsprechend wurde eine verbesserte Transporteffizienz von Signalerkennungspartikel-abhängigen Substraten beobachtet. Diese Ergebnisse stimmten mit den Daten überein, die durch Silencing von hSnd2 gewonnen wurden. Das Modellprotein Cytochrom b5, ein C-terminal verankerte Membranprotein zeigte eine partielle Abhängigkeit vom SND-Weg, basierend auf In-vitro-Translationsassay-Ergebnissen. Die Reexpression von TMEM109 nach Silencing rettete jedoch nicht seine Transporteffizienz zum endoplasmatischen Retikulum. Mithilfe des CRISPR-Cas9-Gen-Editing-Systems wurde eine TMEM109-Knockout-Zelllinie erzeugt. In TMEM109-Knockout-Zellen wurden zu den Knockdown-Proben ähnliche, aber deutlich stärkere, kompensatorische Änderungen beobachtet. Auf Grund der starken kompensatorischen Anpassung konnte die partielle SND-Abhängigkeit des C-terminal verankerten Membranproteins Cytochrom b5 in TMEM109-Knockout-Zellen nicht beobachtet werden. TMEM109 wurde als Kalziumkanal in der Membran des endoplasmatischen Retikulums beschrieben. Live-Cell-Calcium-Imaging hat gezeigt, dass eine geringere TMEM109-Abundanz die Kalzium-Homöostase stören kann. Dies konnte jedoch in den Zellen in denen TMEM109 vollständig fehlt, nicht beobachtet werden. Anhand dieser Ergebnisse nimmt TMEM109 in menschlichen Zellen möglicherweise als Element des SND-Wegs am Transport von Proteinen in das endoplasmatische Retikulum teil. Bisher wurde kein spezifisches Substrat des SND-Weges identifiziert. Weitere Forschungen würden sich mit solchen Proteine befassen, die den SND-Weg für ihren Transport zum endoplasmatischen Retikulum benötigen. Es ist auch möglich, dass der SND-Weg entweder bereits bekannte Transportwege ergänzt oder unter bestimmten zellulären Umständen aktiviert wird.