Retinoid induzierte Transktionsänderungen in primären Limbusepithelzellen im Kontext von Aniridie-relevanten Transkripten

Abstract

Ziel: Die Retinsäure (RA), ein aktiver Metabolit von Vitamin A, kann über zwei verschiedene Klassen von Retinoidrezeptoren reguliert werden. Dabei handelt es sich um die Retinoid-X-Rezeptoren (RXR) und die Retinsäure-Rezeptoren (RAR). Somit kann die Genregulation auch über diese verschiedenen Rezeptoren erfolgen. RAR und RXR können durch die Bildung von Heterodimeren untereinander wechselwirken. Ein Ziel dieser Arbeit war es, herauszufinden, ob die durch Retinol regulierten Gene direkt über die Retinolrezeptoren (RAR/RXR) gesteuert werden. Hierfür wurden Limbusepithelzellen mit Pan-Rezeptorantagonisten gegen RAR und RXR mit unterschiedlichen Konzentrationen und Inkubationszeiträumen behandelt. Somit konnte beurteilt werden, ob die gemessenen Transkriptänderungen durch die RARs oder die RXRs vermittelt werden. Zur besseren Bewertung sollten die Ergebnisse mit denen der Retinol- und Retinsäurebehandlung verglichen werden, da die gegensätzliche Regulation der Transkripte durch Rezeptorantagonisten im Vergleich zur Retinoidbehandlung zusätzlich für eine Regulation der veränderten Transkripte durch RAR/ RXR spricht. Methoden: Die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente wurden an Limbusepithelzellen (LEZ) durchgeführt. Diese Versuchszellen stammen von Hornhautspenden der LIONS Hornhautbank Saar-Lor-Lux Trier/ Westpfalz. Die Gewinnung und Isolation von LEZ aus dem Gewebe erfolgte mittels einer 1,5 mm Biopsie Stanze. Das gewonnene Präparat wurde in Keratinozyten Serumfreiem Medium (KSFM), supplementiert mit EGF und BPE, kultiviert. Nach ausreichender Konfluenz und mehrfacher Teilung der Probe wurden vier Schälchen des gleichen Spenders mit Pan-Retinoidrezeptorantagonisten (UVI 3003, AGN 193109) in unterschiedlichen Konzentrationen (0,5 µM, 1,0 µM, 1,5 µM) und Inkubationszeiträumen (24 h, 48 h) behandelt. Anschließend konnte mittels der quantitativen Polymerasekettenreaktion (qPCR) die mRNA-Expression der folgenden Transkripte gemessen werden: die Stammzell- und Differenzierungsmarker PAX6, ADH7, ALDHA1A1 und ABCG2, die Strukturproteine KRT3, KRT12, KRT19 und DSG1, Transkripte, die den Fettstoffwechsel beeinflussen FABP5, ELOVL7 und PPARG, der Proliferationsmarker KI67, Transkripte, die bei der Angiogenese eine Rolle spielen, VEGFA und andere Marker wie CRABP2, RBP1, RDH10, SPINK7 und STRA6. Durch die qPCR konnten Aussagen über die Hoch- bzw. Herunterregulation eines Gens oder einer mRNA im Vergleich zu der Kontrolle getroffen werden. Als Referenzgene wurden das TATA binding Protein (TBP) und die B-Glucuronidase (GUSB) eingesetzt. Ergebnisse: Anhand der mRNA-Expression konnte für einige Transkripte eine RAR- bzw. RXR- Abhängigkeit nachgewiesen werden. Die Transkripte DSG1, KRT3, KRT12 und KRT19 erwiesen sich hierbei als RAR-abhängig. Diese Gene könnten somit statt direkt über PAX6 auch über einen veränderten Retinolstoffwechsel beeinflusst sein. Bei den anderen untersuchten Transkripten war die Regulation durch die Retinoide weniger eindeutig. Diese konnten keiner spezifischen Rezeptorgruppe zugeordnet werden. Die Transkripte DSG1, KRT3, KRT12, KRT19, CRABP2, ADH7 und SPINK7 zeigten signifikante gegenteilige Regulationen in Bezug auf die Behandlung mit Retinolderivaten und Pan-Retinoidrezeptorantagonisten auf. Schlussfolgerung: Anhand der Expressionsdaten konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass es für Teile der untersuchten Transkripte eine definierte Abhängigkeit von RAR oder RXR gibt. Allerdings konnten nicht alle einer spezifischen Rezeptorgruppe zugeordnet werden. Es konnten Belege gesammelt werden, dass DSG1 und die Keratine statt direkt über PAX6 auch über einen veränderten Retinolstoffwechsel beeinflusst werden könnten. Dies lässt die Spekulation zu, dass einige der im Patienten beobachteten Transkriptänderungen nicht direkt durch PAX6 reguliert werden. Es kann vermutet werden, dass die PAX6 Haploinsuffizienz Auswirkungen auf den Retinsäurestoffwechsel hat. Dies sollte in der Zukunft genauer untersucht werden. Im Vergleich mit vorherigen Versuchen zeigte sich für einige weitere Transkripte eine jeweils umgekehrte Genregulation bezüglich der Behandlung mit Retinolderivaten und Retinoidrezeptorantagonisten. Diese werden höchstwahrscheinlich über den Retinolstoffwechsel reguliert.

Purpose: Retinoic acid (RA), an active metabolite of vitamin A, can be regulated by two different classes of retinoid receptors. These are the retinoid X receptors (RXR) and the retinoic acid receptors (RAR). Thus, gene regulation may also occur through these different receptors. RAR and RXR can interact with each other and form heterodimers. One aim of this dissertation was to find out whether retinol-regulated genes are directly controlled by retinol receptors (RAR/RXR). For this purpose, limbal epithelial cells were treated with pan-receptor antagonists against RAR and RXR with different concentrations and incubation periods. Thus, it could be assessed whether the measured transcript changes were mediated by the RARs or the RXRs. For a better evaluation, the results were compared with those of retinol and retinoic acid treatment, because the opposite regulation of the transcripts by receptor antagonists compared with retinoid treatment additionally argues for a regulation of the altered transcripts by RAR/ RXR. Methods: The experiments performed in this dissertation were performed on limbal epithelial cells (LEC). These experimental cells were obtained from corneal donations of the LIONS Cornea Bank Saar-Lor-Lux Trier/ Westpfalz. LEC were isolated from the tissue using a 1.5 mm biospie punch. The obtained preparation was cultured in keratinocyte serum-free medium (KSFM) supplemented with EGF and BPE. After sufficient confluence and multiple divisions of the sample, 4 dishes from the same donor were treated with pan retinoid receptor antagonists (UVI 3003, AGN 193109) at different concentrations (0.5 µM, 1.0 µM, 1.5 µM) and incubation periods (24 h, 48 h). Subsequently, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was used to measure the mRNA expression of the following transcripts: Stem cell and differentiation markers PAX6, ADH7, ALDHA1A1 and ABCG2, structural proteins KRT3, KRT12, KRT19 and DSG1, transcripts affecting lipid metabolism FABP5, ELOVL7 and PPARG, proliferation marker KI67, transcripts involved in angiogenesis VEGFA and other markers such as CRABP2, RBP1, RDH10, SPINK7 and STRA6. By qPCR, upregulation or downregulation of a gene or mRNA compared to the controls could be analysed. TATA binding protein (TBP) and B-glucuronidase (GUSB) were used as reference genes. Results: Based on mRNA expression, RAR or RXR dependency could be detected for some transcripts. The transcripts DSG1, KRT3, KRT12 and KRT19 were found to be RAR-dependent. Thus, these genes could be affected by altered retinol metabolism instead of a direct effect via PAX6. In the other transcripts examined, regulation by retinoids was less clear. These could not be assigned to a specific receptor group. The transcripts DSG1, KRT3, KRT12, KRT19, CRABP2, ADH7, and SPINK7 showed significant opposite regulation in relation to treatment with retinol derivatives and pan-retinoid receptor antagonists. Conclusion: Based on our data, it could be shown that there is a defined dependence on RAR or RXR for some of the studied transcripts. However, not all could be assigned to a specific receptor group. We could collect evidence that DSG1 and the keratins could also be influenced by altered retinol metabolism, instead of a direct effect via PAX6. Therefore some of the transcript changes, observed in patients are not directly regulated by PAX6. It can be speculated that PAX6 haploinsufficiency has effects on retinoic acid metabolism, which should be investigated in more detail in the future. In comparison with previous experiments, some additional transcripts showed a respective reverse gene regulation with respect to treatment with retinol derivatives and retinoid receptor antagonists. These are most likely regulated via retinol metabolism.