Evaluation of the GLAST-CreERT2/loxP system to knock out receptor proteins in mouse astrocytes

Abstract

Astrocytes express a variety of transmitter receptors. To clarify their function in vivo cell type specific knockout models have been generated which enable the ablation of targeted receptors. To faithfully correlate an observed phenotype to a specific brain region and cell type the efficiency and specificity of recombination of floxed sequences is of high relevance. In the current study we investigated in a quantitative manner recombination events of the astrocyte-specific and inducible GLAST-CreERT2 mouse line (Mori et al., 2006) throughout the brain. In the cerebellum and cortex, we quantified the increase of recombined receptor genes and determined that three injections of tamoxifen and 21 days are efficient to achieve maximum DNA recombination. Subsequently we quantified the loss of intact alleles after induction of Cre activity. Two floxed receptor alleles (p2ry1, gabbr1) and the tdTomato reporter allele showed no significant differences in regard to DNA recombination efficiencies and no difference between genders. For one targeted receptor allele (grin1) we observed significantly less recombination events independent of the age of injected mice and distance between LoxP sites. Furthermore, the same locus displayed efficient recombination by use of an oligodendrocyte-specific Cre driver line. In conclusion the GLAST-CreERT2/loxP system was highly efficient to recombine floxed sequences but epigenetic regulations, like silencing leading to closed chromatin structures and difficulties for the Cre enzyme to access loxP sites have to be investigated for each floxed target gene individually. However, GLAST+ cells were equated as astrocytes and the recombination efficiencies as a quantitative measure of astrocytes in the respective brain regions. We concluded that in a brain of a young adult mouse 20 % in the brainstem, 8 % in the cerebellum, 22 % in the cortex, 30 % in the hippocampus and 31 % in the optic nerve account for astrocytes. In addition, we confirmed by use of the tdTomato reporter mice that predominantly astrocytes are targeted and the difficulty to investigate brain regions affected by adult neurogenesis because here GLAST+ progenitor cells differentiate into granule cells and interneurons. Furthermore FACS sorting of tdTomato reporter cells revealed a higher and lower fluorescent population, which could be appointed to astrocytes and microglia respectively. In the second part we addressed the role of astroglial NMDA receptors with special emphasis on the cortex by generating conditional mutants where the obligatory GluN1 subunit is ablated. Efficient reduction of GluN1 mRNA was determined in isolated cortical astrocytes by FACS sorting. Furthermore, synaptically evoked currents of patched cortical astrocytes lacking the GluN1 subunit showed no sensitivity to NMDA receptor antagonists. Under physiological conditions astrocytes expressed NMDA receptors in low densities. Expression was upregulated after brain injury suggesting an important role for astroglial NMDA receptors under pathological conditions. In addition we provided further evidence at the mRNA and protein level that the astroglial NMDA receptor incooperates the GluN2C subunit. Finally we investigated the function of purinergic astroglial P2Y1 receptors in the brain by generating conditional knockout mice where the receptor could be efficiently ablated in a timely controlled manner. Our findings suggest that astrocytes are the predominat cell type in the brain expressing the P2Y1 subtype. In the cerebellum P2Y1 receptor expression is not restricted to young ages, but is disposable for Purkinje cell-parallel fiber synapse formation or maintenance.

Astrozyten exprimieren eine Vielzahl an Transmitterrezeptoren. Um die funktionelle Bedeutung in vivo zu untersuchen, wurden Zelltyp-spezifische knock-out Modelle generiert. Diese erlauben eine kontrollierte Exzision von Genabschnitten von Rezeptoren. Um den beobachteten Phenotyp auf eine bestimmte Hirnregion und Zelltyp zurückführen zu können, ist Effizienz und Spezifität der DNA Rekombination von hoher Bedeutung. In dieser Studie wurden Rekombinationsereignisse durch die Astrozyten-spezifische und Tamoxifen-induzierbare GLAST-CreERT2 Mauslinie (Mori et al., 2006) quantitativ untersucht. Im Cerebellum und Cortex wurde die Zunahme von rekombinierten Rezeptorgenen quantifiziert und festgestellt, dass drei Injektionen von Tamoxifen und 21 Tage ausreichen, um eine maximale Rekombinationseffizienz zu erreichen. Im Folgenden wurde die Abnahme von intakten Allelen nach Induktion der Cre Aktivität bestimmt. Zwei untersuchte Rezeptorgene (p2ry1, gabbr1) und das tdTomato Reportergen zeigten keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf DNA Rekombiationseffizienzen bzw. Unterschiede zwischen Geschlechtern. Bei einem gefloxtem Rezeptorgen (grin1) wurde eine geringere Rekombinationseffizienz beobachtet unabhängig von dem Alter der injizierten Mäuse oder dem Abstand zwischen den loxP Stellen. Weiterhin zeigte derselbe Genlocus effiziente Rekombinationsereignisse wenn eine oligodendrozytenspezifische Cre Maus Linie benutzt wurde. Daraus kann abgeleitet werden, dass das GLAST-CreERT2/loxP System äußerst effizient gefloxte Genabschnitte in Astrozyten rekombiniert. Epigenetische Regulationen, wie posttrankriptionelles Gen-silencing das zu einer geschlossenen Chromatin Struktur und Schwierigkeiten für die Cre DNA Rekombinase den Lokus zu betreten führt, müssen für jedes gefloxte Gen individuell untersucht werden. GLAST+ Zellen wurden mit Astrozyten gleichgesetzt und die Rekombinations-effizienz als quantitatives Maß für die Anzahl von Astrozyten per Hirnregion angenommen. In einer erwachsenen Maus besteht der Hirnstamm somit zu 20 %, das Cerebellum zu 8 %, der Cortex zu 22 %, der Hippocampus zu 30 % and der optische Nerv zu 31 % aus Astrozyten. Zusätzlich wurde mit Hilfe der tdTomato Reporter Maus bestätigt, dass hauptsächlich Astrozyten von der DNA Rekombination betroffen sind und es schwierig ist Regionen der adulten Neurogenese zu untersuchen, da hier GLAST+ Vorläuferzellen rekombiniert werden und zu Interneuronen und Körnerzellen differenzieren. Weiterhin wurde bei FACS Experimenten mit tdTomato Reportermäusen zwei fluoreszente Populationen entdeckt, wobei die schwächer fluoreszente Population als Mikroglia und die stärker fluoreszente als Astrozyten identifiziert wurde. Im zweiten Teil der Studie wurde die Rolle von astroglialen NMDA Rezeptoren mit Schwerpunkt auf dem Cortex untersucht. Dafür wurde in konditionalen Mausmutanten die obligatorische GluN1 Untereinheit inaktiviert. Eine effiziente Reduktion der GluN1 mRNA wurde in FACS sortierten kortikalen Astrozyten nachgewiesen. Zusätzlich zeigten gepatchte knockout Astrozyten keine Sensitivität gegenüber NMDA Rezeptor Antagonisten. Unter physiologischen Bedingungen exprimierten Astrozyten eine geringe Dichte an NMDA Rezeptoren. Die Expression war nach einer Hirnverletzung hochreguliert, was auf eine stärkere Rolle von NMDA Rezeptoren unter pathologischen Bedingungen hinweist. Zusätzlich wurden weitere Indizien gefunden, dass astrogliale NMDA Rezeptoren die Untereinheit GluN2C inkooperieren. Letztlich wurde die Funktion von purinergen astroglialen P2Y1 Rezeptoren durch die Generierung eines konditionalen Mausmodells untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Astrozyten der primäre Zelltyp für die Expression von P2Y1 Rezeptor mRNA im Gehirn darstellen. Im Kleinhirn wurde gezeigt, dass die Expression von P2Y1 Rezeptoren nicht auf junges Alter limitiert ist. Desweiteren sind P2Y1 Rezeptoren nicht an der Bildung bzw. Erhaltung von Purkinjezell-Parallel Faser - Synapsen beteiligt.