Der murine TRPM5-Kanal und die Entzündung der unteren Atemwege nach Bürstenzellstimulation.

Abstract

Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der längerfristigen Beobachtung der Entzündungsreaktion in den unteren Atemwegen der Maus nach Stimulation der trachealen Bürstenzellen mit Denatonium. Der TRPM5-Kanal ist als Kationenkanal an der Signalkaskade der trachealen chemosensorischen Bürstenzelle beteiligt, von welcher zunehmend immunologische Funktionen bekannt werden. Durch Aktivierung der Bittersignalkaskade kommt es zum Kationeneinstrom durch den TRPM5-Kanal in die Bürstenzelle, wodurch es zur Depolarisation und Ausschüttung von Acetylcholin kommt. Das Acetylcholin führt über nikotinische Acetylcholinrezeptoren an Neuronen zur neuronalen Freisetzung von Substanz P und CGRP. Es werden Immunzellen rekrutiert. Bis dato wurde diese Form der Entzündung in der Trachea nach Denatoniuminhalation nur 30 min nach der Inhalation untersucht. Die vorliegende Arbeit hatte als Zielsetzung, die Form dieser Entzündungsreaktion über 7 Tage hinweg zu dokumentieren und die Rolle des TRPM5-Kanals weiter zu erforschen. Ebenfalls sollte das Verhalten der Bürstenzellen über diesen längeren Zeitraum beobachtet werden. Die tierexperimentellen Versuche fanden an TRPM5+/+- und TRPM5-/--Mäusen statt. Hierzu wurden für jeden Mausstamm 5 Versuchsgruppen erstellt: jeweils eine reine Kontrollgruppe mit keinerlei Eingriff, eine Gruppe mit Inhalation der Pufferlösung und Tötung nach 1 Tag, eine Gruppe mit Inhalation von 1 mM Denatonium und Tötung nach 1 Tag, sowie nach 3 Tagen und 7 Tagen. Die beiden erstgenannten Gruppen dienten als Kontrollgruppen. Das Denatonium wurde in einem Phosphatpuffer gelöst und durch das Ligamentum conicum in den kranialen Abschnitt der Trachea injiziert. Je nach Gruppe erfolgte dann die Perfusion der Tiere am entsprechenden postoperativem Tag. Lungen und Trachea wurden histologisch aufgearbeitet und immunhistochemisch gefärbt, um mittels Fluoreszenzmikroskopie die Zellen darstellen, lokalisieren und quantifizieren zu können. Anhand dieser Methodik konnten wir eine TRPM5-abhängige Expansion der Bürstenzellen mit einem Maximum am 3. Tag nach Inhalation feststellen. Die Zahl der Bürstenzellen wies eine positive lineare Korrelation mit der Anzahl an dendritischen Zellen in der Trachea auf. Diese Korrelation könnte als synergistische Stärkung der Immunkompetenz bei den Wildtypen gedeutet werden. Besagte Immunkompetenz zeigte sich bei den Wildtypen stärker als bei den TRPM5-/--Tieren, im Sinne einer Einbindung des Komplementsystems und einer Steigerung der Abwehkraft der Lunge nach sieben Tagen (Neutrophile als «first responder»). Auch der unerwartete Anstieg der T- Lymphozyten und die hohe interindividuelle Variabilität der Neutrophilen bei den TRPM5-/--Tieren (und ihre überschießende Rekrutierung in die Trachea nach einem und sieben Tagen) spricht für ein dysreguliertes Immunsystem.All diese Ergebnisse lassen zusammenfassend auf eine immunregulatorische Funktion des TRPM5-Kanals und somit der Bürstenzellen schließen. Die Frage ob Denatonium eines Tages als Pharmakon zur Therapie oder Prophylaxe von Pneumonien genutzt werden könnte, kann mit den vorliegenden Ergebnissen nicht endgültig beantwortet werden. Hierzu ist noch weitere Forschungsarbeit nötig; die hier vorgestellten Ergebnisse schließen eine derartige Anwendung in der Zukunft jedoch nicht aus. Besonders die hier beschriebene immunregulatorische Funktion des TRPM5-Kanals könnte in Zukunft viele Ansätze im Bereich von Autoimmunerkrankungen bieten. Auch in der Prophylaxe von infektiösen oder entzündlichen Erkrankungen mit überschießenden Immunreaktionen, wie SARS-2-Covid-19-Pneumonien, könnten Anwendungsbereiche liegen.

The aim of the present study was the long-term observation of the inflammatory reaction in the lower respiratory tract of the mouse after denatonium inhalation via the trachea. The TRPM5 channel is involved as a cation channel in the signalling cascade of the tracheal chemosensory brush cell, of which increasing immunological functions are known. Activation of the bitter signalling cascade leads to cation influx through the TRPM5 channel into the brush cell, resulting in depolarisation and the release of acetylcholine. Acetylcholine leads via nicotinic acetylcholine receptors to the neuronal release of substance P and CGRP. In consequence different types of immune cells are recruited. Until now, this form of inflammation in the trachea after denatonium inhalation has been investigated only for a 30 min period. The aim of this study was to document the nature of this inflammatory reaction over 7 days and to further investigate the role of the TRPM5 channel. The behaviour of the brush cells has also been observed over this longer period. The experiments were performed with TRPM5+/+ and TRPM5-/- mice. Five experimental groups were created for each genotype: one group without any intervention, one group with injection of buffer solution and killing after 1 day, one group with injection of 1mM denatonium and killing after 1 day, one group with killing after 3 days and another after 7 days. The first two groups were used as control groups. Denatonium was dissolved in a phosphate buffer and injected through the Ligamentum conicum into the cranial section of the trachea. Depending on the group, the animals were then perfused on the corresponding postoperative day. Lungs and trachea were histologically processed and immunohistochemically stained in order to visualize and quantify the cells by fluorescence microscopy. Using this methodology, we could determine a TRPM5-dependent expansion of the brush cells with a maximum on the 3rd day after inhalation. The number of brush cells showed a positive linear correlation with the number of dendritic cells in the trachea. This correlation could be interpreted as a synergistic strengthening of immunocompetence in wildtypes. This immunocompetence was stronger in the wildtypes than in the TRPM5-/--animals, in the sense of an activation of the complement system and an increase of the lung's defensive power after seven days (neutrophils as "first responder"). The unexpected increase in T-lymphocytes and the high inter-individual variability of neutrophils in the TRPM5-/--animals (and their excessive recruitment into the trachea after one and seven days) also speaks for a dysregulated immune system. All these results together suggest an immunoregulatory function of the TRPM5 channel and thus of the brush cells. The question if denatonium could one day be used as a pharmaceutical for the therapy or prophylaxis of pneumonia cannot be answered finally with the present results. Much more further research work is required for this; however, the results presented here do not rule out such an application in the future. Especially the immunoregulatory function of the TRPM5 channel described here could offer many approaches in the field of autoimmune diseases. The prophylaxis of infectious or inflammatory diseases with excessive immune reactions, such as SARS-2-Covid-19 pneumonia, could also be a field of application.