Chondrozyten in Umgebungen mit hoher Dichte

Abstract

Fragestellung: Rekombinante adeno-assoziierte virale (rAAV) Vektoren können therapeutische Genprodukte bereitstellen und sind daher eine experimentelle Therapieoption der frühen Gonarthrose. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, mittels eines rAAV-Vektors, der für den chondrogenen Transkriptionsfaktor SOX9 (rAAV-FLAG-hsox9) kodiert, strukturelle Merkmale des hyalinen Gelenkknorpels selektiv zu verstärken. Dreidimensionale (3D) gerüstfreie Zellkonglomerate aus primären humanen adulten normalen oder arthrotischen Chondrozyten dienten als klinisch-relevantes Modellsystem. Der erste Studienarm befasst sich am Beispiel beider Zelltypen im Pelletmodell mit der Untersuchung des Gentransfers eines therapeutischen Vektors, rAAV-FLAG-hsox9, im Vergleich zur Transduktion der Markervektoren rAAV-lacZ und rAAV-RFP. Der zweite Studienarm erforscht als Machbarkeitsstudie die Möglichkeit der Vektortransduktion in einem neuartigen knorpelähnlichen Modellsystem („cartilage tissue analog“ = CTA), im Folgenden als Knorpelgewebe-Analogon bezeichnet, dessen Synthese zuvor lediglich mit fetalen bovinen Chondrozyten realisiert wurde.

Methoden: In der Pelletstudie wurden Aggregate auf der Basis von humanen adulten normalen und arthrotischen Chondrozyten mittels rAAV mit therapeutischen Genen und Markergenen transduziert und bis zu 21 Tagen untersucht. Die Knorpelgewebe-Analogon-Studie überprüfte einerseits die Durchführbarkeit der Gewebeszüchtung aus primären humanen Chondrozyten, andererseits den rAAV-vermittelten Gentransfer in diese knorpelähnlichen Strukturen mit anschließenden Beobachtungszeiträumen von bis zu 84 Tagen.

Ergebnisse: Pellets aus humanen adulten normalen und arthrotischen Chondrozyten waren mittels rAAV-Vektor vergleichbar transduzierbar, ohne negative Auswirkungen auf die Viabilität der Zellen. In beiden Zellarten kam es zu einer signifikanten Steigerung der Typ-II-Kollagen-Expression um das bis zu 2,7-fache nach Transduktion mit rAAV-FLAG-hsox9 im Vergleich zur Kontrollgruppe. Zudem verminderte sich die Typ-X-Kollagen-Expression auf bis zu 1/3 des Vergleichswertes. Die Daten der Knorpelgewebe-Analogon-Studie belegen eine erfolgreiche Herstellung eines humanen Knorpelanalogons. Des Weiteren ist in diesen Knorpelanalogons eine erfolgreiche Transgenexpression über einen Zeitraum von bis zu 84 Tagen nachweisbar. Schlussfolgerungen: Die Transduktion von humanen adulten normalen und arthrotischen Chondrozyten mit rAAV-sox9 führt zu einer signifikanten Expression von Markern der Chondrogenese bei gleichzeitiger Reduktion von Hypertrophiemarkern. Somit stellt sox9 ein potentielles Kandidatengen zur Gentherapie der Arthrose dar. Die Ergebnisse zeigen zudem den positiven, langfristen Einfluss auf gesundes Gewebe, was bei der möglichen klinischen Anwendung bei der Therapie fokaler Knorpeldefekte oder unikompartimentaler Arthrose von Bedeutung sein könnte. Die Technik der Knorpelgewebe-Analogon-Synthese bietet ein neues in-vitro-Forschungsobjekt, das Charakteristika des in-vivo-vorliegenden Knorpelgewebes imitiert. Zudem sind diese Analoga als potenzieller Gewebeersatz bei der Therapie fokaler Defekte verwendbar. Weitere Studien werden die mögliche Kombination mit therapeutischen Vektoren in diesen 3D-Systemen von Chondrozyten in Umgebungen mit hoher Dichte untersuchen.

Introduction: Recombinant adeno-associated viral (rAAV) vectors offer a possible approach for early osteoarthritis (OA) therapy of the knee. The goal of this thesis is to test the ability of a therapeutic rAAV vector coding for the highly chondrogenic SOX9 transcription factor (rAAV-FLAG-hsox9) to enhance the cartilage-specific activities in human osteoarthritic articular chondrocytes (hOACs) relative to human normal articular chondrocytes (hNACs) in conditions that mimic their three-dimensional (3D) environment as a future scaffold-free, cell therapy for OA. The first part of the thesis aimed at investigating how gene transfer with rAAV affect both cell types in a high-density pellet culture model using rAAV-FLAG-hsox9 versus control (marker) rAAV-lacZ and rAAV-RFP gene vectors. The second part of the study examined the feasibility of translating the gene transfer approach in another 3D model based on an in vivo-like cartilage tissue analog (CTA) employed thus far to mimic hyaline cartilage based on the use of bovine articular cartilage.

Methods: In the pellet study, human normal articular chondrocytes and human osteoarthritic articular chondrocytes pellets were transduced by direct administration of the therapeutic and marker gene vectors and evaluation (transgene expression, cellular activities) were monitored for up to 21 days. In the cartilage tissue analog study, rAAV-mediated gene transfer was test-ed as a proof-of-concept using human cells in a relevant cartilage-like structure for up to 84 days.

Results: Pellets prepared using human normal articular chondrocytes and human osteoarthrit-ic articular chondrocytes were equally transduced with rAAV vectors, without deleterious ef-fects on cell viability. Both types of pellets showed a significant increase in type-II collagen expression following transduction with rAAV-FLAG-hsox9 (up to 2.7-fold difference compared with the control rAAV marker treatment) and a concomitant reduction of type-X collagen ex-pression (up to a third of the value of the control marker treatment). In the cartilage tissue ana-log study, successful production of a human articular cartilage 3D analog was achieved and long-term rAAV-mediated gene transfer could be reported over a period of 84 days. Conclusions: Transduction of 3D pellets derived from human normal articular chondrocytes and human osteoarthritic articular chondrocytes using rAAV-FLAG-hsox9 advantageously increases the expression of chondrogenic markers and decrease the expression of markers of hypertrophy. These results support the concept that sox9 gene transfer via rAAV is a promis-ing option for human gene and cell therapy of osteoarthritis. Of note, healthy tissue was also amenable to therapy, which may be of clinical interest when treating focal defects or unilateral damage. The feasibility of creating cartilage tissue analogs offers a new study model in vitro to mimic the target repair tissue for therapy and may be also used as therapeutic platforms for implantation like to treat focal cartilage defects. The potential benefits of this other 3D model using therapeutic rAAV vectors is under examination.