Effekt eines kombinierten rekombinanten adenoassoziierten viralen Gentransfers von hTGF-β und hIGF-I auf die Chondrogenese von humanen mesenchymalen Stromazellen in vitro und in einem humanen osteochondralen Defektmodell ex vivo

Abstract

Zusammenfassung Fragestellung: Fokale osteochondrale Defekte besitzen kein relevantes intrinsisches Heilungspotential. Eine kurative Therapie exisitert nicht. Die direkte Applikation chondrogener Gensequenzen mittels viraler Genvektoren in das Defektareal zur Stimulation intrinsischer chondroreparativer Aktivitäten migrierender mesenchymaler Stromazellen (MSZ) aus dem Knochenmark stellt einen vielversprechenden Therapieansatz dar, ebenso wie die lokale Applikation ex vivo genetisch modifizierter MSZ in das Defektareal. In der vorliegenden Arbeit untersuchten wir den Effekt eines kombinierten rekombinanten adeno-assoziierten viralen (rAAV) Gentransfers der Wachstumsfaktoren des humanen transformierenden Wachstumsfaktors beta (hTGF-ß) und des humanen insulinartigen Wachstumsfaktors I (hIGF-I) auf die chondroreparativen Differenzierungsaktivitäten von humanen MSZ in vitro und nach Implantation in ein humanes osteochondrales Defektmodell ex vivo. Methoden: Humane MSZ und Knorpelproben stammten von Patienten, die sich einer Knie-Totalendoprothesenimplantation unterzogen. Aus isolierten humanen MSZ wurden hochdichte dreidimensionale (3D-) Zellaggregate hergestellt, diese für 24 h in definiertem chondrogenen Medium kultiviert und anschließend mit rAAV-Vektoren wie folgt transduziert: hTGF-ß/hIGF-I, hTGF-ß/lacZ, hIGF-I/lacZ, Reporter-lacZ. Die transduzierten humanen 3D-Zellaggregate wurden 21 Tage in chondrogenem Medium bei 37 °C kultiviert (direkter in vitro-Ansatz) oder 24 h nach erfolgter Transduktion in ein humanes osteochondrales Defektmodell ex vivo implantiert und folgend in chondrogenem Medium 21 Tage bei 37 °C kultiviert (indirekter ex vivo-Ansatz). Die chondroreparativen Potentiale der humanen MSZ beider Kulturmodelle wurden mittels biochemischen, histologischen, immunhistochemischen sowie Real-time RT-PCR- und Transgenexpressions-Analysen evaluiert. Ergebnisse: Die kombinierte rAAV-basierte Überexpression von hTGF-ß/hIGF-I resultierte in humanen MSZ in vitro und nach Implantation in ein humanes osteochondrales Defektmodell ex vivo nach 21 Tagen in verbesserten chondroreparativen Differenzierungsaktivitäten im Vergleich zur singulären viralen Genapplikation und zur Negativkontrolle. Die kombinierte rAAV-hTGF-ß/hIGF-I-Überexpression in humanen MSZ erreichte signifikante Verbesserungen in vitro und im humanen osteochondralen Defektmodell ex vivo bezüglich einer erhöhten Zelldichte, eines erhöhten Proteoglykan- und Typ-II-Kollagen-Gehalts und eines verminderten Typ-I- und Typ-X-Kollagen-Gehalts. Schlussfolgerung: Die kombinierte lokale direkte und indirekte Applikation multipler therapeutischer rAAV-Vektoren in osteochondrale Defekte sind attraktive Ansätze, deren regeneratives Potential in klinisch-relevanten Großtierstudien evaluiert werden sollte, um auf dieser Basis künftig innovative Therapien zu entwickeln.

Abstract Introduction: Focal osteochondral defects do not regenerate. There is no curative treatment to date for these clinical problems. The direct application of chondroreparative gene vectors in cartilage defects is a powerful approach to directly stimulate the regenerative activities of migrating bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (MSCs), as well as a local administration of ex vivo genetically modified MSCs to sites of cartilage injury. Here, we investigated the ability of combined recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector-mediated delivery of the potent human transforming growth factor beta (hTGF-ß) and human insulin-like growth factor I (hIGF-I) to enhance the processes of chondrogenic differentiation in human MSCs in vitro and upon implantation in a model of a human osteochondral defect ex vivo. Methods: Human MSCs and articular cartilage biopsies were obtained from patients undergoing total knee arthroplasty. Isolated human MSCs were pelleted and kept in chondrogenic medium for 24 h prior to transduction with the following rAAV vectors: hTGF-ß/hIGF-I, hTGF-ß/lacZ, hIGF-I/lacZ, and reporter-lacZ (negative control). Transduced aggregates were kept as high-density aggregate cultures in chondrogenic medium for up to 21 days at 37 °C (direct in vitro-approach) or implanted in an explant model of a human osteochondral defect (indirect ex vivo-approach) 24 h post-transduction and kept in chondrogenic medium for up to 21 days at 37 °C. After 21 days, MSC chondrorepatative activities in vitro and ex vivo were evaluated using established biochemical, histological, immunohistochemical, real-time RT-PCR and ELISA analyses. Results: Successful concomitant overexpression of hTGF-ß/hIGF-I via rAAV led to enhanced proliferative, anabolic, and chondrogenic activities in vitro and ex vivo while restraining undesirable osteogenic and hypertrophic differentiation. Concomitant rAAV-hTGF-ß/hIGF-I overexpression significantly improved cellular densities as well as the proteoglycan and type-II-collagen contents while significantly reducing type-I- and type-X-collagen contents. Conclusion: Direct and indirect local application of multiple therapeutic rAAV vectors to sites of osteochondral injury are promising approaches and may be tested for their regenerative potential in clinically relevant large animal models as a means to develop innovative clinical therapies in the future.