Immunhistochemische Charakterisierung des Expressionsmuster von TIAM1 in der Mausretina

Abstract

Die Ribbonsynapse ist eine spezialisierte, kontinuierlich aktive, chemische Synapse, die außer in der Retina nur noch in der Cochlea, im Vestibularorgan und in der Epiphyse zu finden ist. Sie zeichnet sich durch das Vorhandensein eines besonderen Zellorganells aus: dem synaptischen Ribbon. Das synaptische Ribbon kann man sich dabei als eine Art „Förderband“ für neurotransmittergefüllte Vesikel in Richtung der präsynaptischen Membran vorstellen. Dadurch kann der hohe Bedarf an Neurotransmittern im synaptischen Spalt der Photorezeptorzelle für einen optimalen Ablauf der Signalweiterleitung gewährleistet werden. Die Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. Schmitz (Anjum et al. 2014) konnte in diesem Zusammenhang die Proteine CASK und Caskin1 im Bereich der aktiven Zone der Photorezeptorzellsynapse nachweisen. Die aktive Zone der präsynaptischen Membran ist ein Bereich, in dem die Exozytose in unmittelbarer Nähe zu Calciumkanälen stattfindet. Die Ribbons sind mit dieser aktiven Zone assoziiert, wo es über verschiedene intra- und extrazelluläre Signale zu einem besonders intensiven Umbau des Aktinzytoskeletts kommt. Dadurch kann der optimale Ablauf der zahlreichen exo- und endozytotischen Prozesse gewährleistet werden. Durch die Fähigkeit der Steuerung der Aktinpolymerisation kann davon ausgegangen werden, dass CASK und sein Interaktionspartner Caskin1 in diesem Zusammenhang eine wesentliche Rolle innehaben. Caskin1 interagiert dabei über eine bestimmte Proteinsequenz mit CASK, die nur noch in wenig anderen Proteinen vorhanden ist. Stafford et al. (2011) konnte durch Proteindatenbankuntersuchungen die gleiche Sequenz in TIAM1 identifizieren und nachweisen, dass zumindest in vitro eine Interaktion mit CASK möglich ist und beide zudem überlappende Funktionen haben. TIAM1 ist als Rac-spezifischer Austauschfaktor (GEF) an der Steuerung der Rho-ähnlichen GTPase beteiligt und somit in der Lage die Aktinpolymerisation spezifisch zu steuern. Dies ist beispielsweise essenziell für Zellmigration, Invasion und Adhäsion. Das Protein wurde erstmals durch die Arbeitsgruppe Habets et al. 1994 in murinen T-Lymphomzelllinien beschrieben. Dort waren sehr hohe TIAM1 Proteinlevel und verkürzte Varianten, denen die regulatorischen Domänen fehlen, zu finden. Aufgrund der vorhandenen Proteinsequenz und der überlappenden Funktion ist auch eine Interaktion von TIAM1 und CASK in vivo vorstellbar, wodurch die Idee entstand die Expression dieses Proteins in den synaptischen Schichten der Retina zu untersuchen.

Um die Anreicherung von TIAM1 in der präsynaptischen Membran zu untersuchen, verwendete ich die für diesen Zweck im anatomischen Institut der Universität des Saarlandes hergestellten, monoklonalen Antikörper gegen TIAM1 (Klon 7F11, 4D2 und 2D8). Mithilfe Einzel- und Doppelfluoreszenzverfahren konnte ich durch epifluoreszenz- und konfokalmikroskopische Aufnahmen zeigen, dass TIAM1 in der präsynaptischen Terminalen der äußeren und inneren plexiformen Schicht in unmittelbarer Nachbarschaft zu den synaptischen Ribbons zu finden ist. Hierbei verwendete ich Referenzantikörper, die entweder prä-, oder postsynaptische Signale zeigen. Im Unterschied dazu waren in den nukleären Schichten der Retina keinerlei Signale erkennbar. Durch Western-Blot-Untersuchungen konnte ich das Vorhandensein von TIAM1 in der murinen Retina bestätigen. Die Spezifität der Antikörper für das Protein TIAM1 wurden durch Präabsorptions- und DotBlot-Experimente bewiesen. Die Vermutung, dass TIAM1 in der Präsynapse der Photorezeptorzelle vorhanden sein könnte, konnte ich hiermit bestätigen. Ob und wie eine Interaktion mit CASK oder anderen Proteinen stattfindet und wie dadurch genau die Aktinpolymerisation und Morphologie des synaptischen Endknöpfchens beeinflusst wird, müssen weitere Untersuchungen zeigen.

The ribbon synapse is a specialized, continually active chemical synapse that is found only in the retina, the cochlea, the vestibular organ and the pineal gland. It is characterized by the presence of a special organelle called the synaptic ribbon. This synaptic ribbon can be considered as a "conveyor belt" of that guides neurotransmitter-filled vesicles towards the presynaptic membrane. In doing so, the high demand for neurotransmitters in the synaptic cleft of the photoreceptor cell can be met, ultimately ensuring optimal signal transduction. In this context, the research group of Prof. Dr. Schmitz (Anjum et al. 2014) was able to show CASK and Caskin1 in the active zone of the photoreceptor cell synapse. This active zone of the presynaptic membrane is an area where exocytosis takes place in close proximity to calcium channels. The synaptic ribbons are associated with the active zone, where a variety of intracellular and extracellular signals lead to an especially intense restructuring of the actin cytoskeleton, which in turn enables optimal execution of exocytotic and endocytotic processes. Because of their ability to control actin polymerization, it can be assumed that CASK and its interaction partner Caskin1 might play an important role in this context. Caskin1 hereby interacts with CASK through a specific protein sequence found only in a few other proteins. Through the use of protein database analyses, Stafford et al. (2011) were able to identify this same sequence in TIAM1, additionally proving that in vitro interaction with CASK is possible and that the two proteins possess overlapping functions. TIAM1 is involved in the control of the Rho-like GTPase as a Rac-specific exchange factor (GEF) and thus able to deliberately control actin polymerization. This is essential for cell migration, invasion and adhesion. The protein was first described in 1994 by Habets et al., who had discovered high levels of TIAM1 as well as shortened variants thereof within murine T-lymphoma cell lines. Due to their protein sequences and overlapping functions, an in vivo interaction between TIAM1 and CASK is at least plausible, which gave rise to the idea of analyzing the expression of TIAM1 in the synaptic layers of the retina.

To examine the enrichment of TIAM1 in the presynaptic membrane, I used monoclonal antibodies for TIAM1 (clone 7F11, 4D2 and 2D8). These antibodies were developed at the anatomical institute of the University of Saarland for precisely this purpose. Through single and double fluorescence methods, I was able to show by confocal and epifluorescence microscopy that TIAM1 can be found in presynaptic axon terminals of the inner and outer plexiform layer – TIAM1 is therefore present in close proximity to synaptic ribbons. Reference antibodies showed either pre- or postsynaptic signals whereas, in contrast, no signals were visible in the nuclear layers of the retina. Western blot analyses confirmed the presence of TIAM1 in the murine retina and the specificity of the antibodies for TIAM1 was established by pre-absorption and DotBlot experiments. In doing so, I confirmed the assumption that TIAM1 is present in the presynaptic photoreceptor cell. If and how an interaction with Caskin1 or other proteins takes place and how this influences actin polymerization and morphology of the axon terminal must be further investigated.