Molecular Characterization of Clinical Clostridioides difficile Isolates Circulating in the German Healthcare System

Abstract

Clostridioides difficile Infection (CDI) is classified in the USA as an urgent threat by the Centers for Disease Control and Prevention (CDC). CDI is the leading cause of nosocomial diarrhea and accounts for 4% of all hospital acquired infections (HAIs) with ~ 15% case fatality rates. The CDI prevalence is increasing and associated with the rise of the hypervirulent ribotypes (HVR RTs) like RT023, RT027, and RT078. HVR RTs are nowadays responsible for numerous outbreaks in the hospital setting. Usually driven by antibiotic treatment of a hospitalized patient for other reasons, CDI is often difficult to treat by antimicrobials commonly used in the hospital setting, as HVR RT isolates are frequently multidrug-resistant (MDR) (i.e. resistant to three and more antibiotic classes), leaving only a few antibiotics such as vancomycin or fidaxomicin currently as treatments of choice against CDI. Thus, the evaluation of new drug candidates against C. difficile is essential, particularly, in times of emerging antimicrobial resistance (AMR). Ideally, these drug candidates display a high activity against C. difficile but are less effective against other members of the gut microbiota thought to suppress the growth of this pathogen in the colon. My studies show that the natural compound argyrin B and some other argyrin derivatives display a promising in vitro antimicrobial activity against a wide variety of epidemiologically important RTs. Notably, these argyrin derivatives were clearly less effective against some members of the healthy gut flora such as Clostridium scindens, Bacteroides fragilis, and Bifidobacterium bifidum, suggesting that the latter bacterial species might be spared by these drug candidates when used for treatment of CDI and thus may help also to prevent the recurrence, which is a common feature of this disease. First preliminary drug susceptibility tests were also carried out for new nucleoside analogues and C. difficile, which suggest that some of these compounds might be also effective against this bacterial species in the low μg/mL range. Further in vitro drug testing studies revealed a promising activity for the Energy coupling factor transporters inhibitors K4104497 and HHPS77 against Clostridium perfringens in the low μg/mL range, while growth of other Clostridium spp. and C. difficile was less affected. Knowledge about the C. difficile strain composition circulating in Germany and their AMR profiles is important for epidemiological and therapeutic reasons. The implementation of a standardized German-wide surveillance for C. difficile in the German hospital setting was thus an important aim of this work and was successfully attained to detect the circulating RTs and their AMR profiles. This study allows for the first time to get an idea about the real situation in the clinical setting by avoiding the bias by the disease severity or the random acquisition of isolates. This study revealed that isolates of the HVR RT027 are less frequently seen nowadays in the German healthcare system than before, and basically the same holds truth for the in Europe epidemiologically relevant RT001, for which the incidence also declined in recent years. MDR was encountered on a low level, but was particularly evident for RT027, supporting earlier findings suggesting that this HVR RT is a major driver for MDR. Abstract 18 The identification of C. difficile HVR RTs by ribotyping or whole genome sequencing is costly and time consuming. In order to find a cost-effective and swift way to reliably discriminate between HVR RTs and non-HVR RTs, MALDI-TOF MS was tested here in combination with bioinformatics as third part of my thesis for its suitability to distinguish between both aforementioned groups. Here, my studies revealed that epidemiologically relevant HVR RTs circulating in Europe, such as RTs 023, 027, 045, 078, 126 and 176, could be indeed distinguished by this method from non-HVR-RTs with an accuracy >95% when MALDI-TOF mass spectra were compared to a TICp-based peak matrix in combination with the RF (random forest) or PLS-DA (partial least squares-discriminant analysis) prediction algorithms. A closer look at the HVR RTs revealed that some of the C. difficile HVR RTs such as RTs 023 and 027/176 could be even further subcategorized with an accuracy >94% from other HVR RTs circulating in Germany such as RTs 045, 078, 126 and 127. These findings suggest that MALDI-TOF MS is a fast and powerful tool to inform the clinician if a CDI is caused by a HVR C. difficile isolate that may require special attention.

Zusammenfassung Die Clostridioides-difficile-Infektion (CDI) wird in den USA von den Centers for Disease Control and Prevention (CDC) als dringende Gefahr für das Gesundheitssystem eingestuft. CDI ist die Hauptursache für nosokomiale Durchfallerkrankungen und macht 4% aller im Krankenhaus erworbenen Infektionen aus, wobei die Sterblichkeitsrate bei etwa 15% liegt. Die Prävalenz von CDI nimmt aktuell zu und dies steht vermutlich im Zusammenhang mit dem Auftreten und der Verbreitung hypervirulenter Ribotypen (RTs) wie den RTs 023, 027 und 078. Hypervirulente C. difficile RTs (HVR-RTs) sind heutzutage für zahlreiche Ausbrüche im Krankenhausumfeld verantwortlich. Da HVR-RT-Isolate häufig multiresistent (MDR) sind (d. h. resistent gegen drei und mehr Antibiotikaklassen), bleiben nur wenige Antibiotika wie Vancomycin oder Fidaxomicin als Mittel der Wahl zur Behandlung von CDI übrig. Daher ist die Evaluierung neuer Wirkstoffkandidaten gegen C. difficile, insbesondere in Zeiten, in denen immer häufiger antimikrobielle Resistenzen (AMR) beobachtet werden, von entscheidender Bedeutung. Im Idealfall zeigen diese Wirkstoffkandidaten eine hohe Aktivität gegen C. difficile, sind aber gegen andere Mitglieder der Darmmikrobiota weniger wirksam, von denen angenommen wird, dass sie das Wachstum dieses Erregers im Dickdarm unterdrücken. Meine Studien zeigen, dass die natürliche Verbindung Argyrin B und einige andere Argyrin-Derivate eine vielversprechende In-vitro-Aktivität gegen eine Vielzahl von epidemiologisch wichtigen C. difficile RTs aufweisen. Bemerkenswert ist zudem, dass diese Argyrinderivate gegen einige Mitglieder der gesunden Darmflora wie Clostridium scindens, Bacteroides fragilis und Bifidobacterium bifidum deutlich weniger wirksam waren, was darauf hindeutet, dass die letztgenannten Bakterienarten bei der Behandlung von CDI durch diese Arzneimittelkandidaten verschont werden und somit auch zur Verhinderung von Rückfällen, die ein häufiges Merkmal dieser Krankheit sind, beitragen könnten. Für die neuen Nukleosidanaloga wurden auch erste vorläufige Empfindlichkeitstests gegenüber C. difficile durchgeführt, die darauf hindeuten, dass einige dieser Verbindungen auch gegen diese Bakterienart im niedrigen μg/mL-Bereich wirksam sein könnten. Weitere In-vitro-Wirkstofftests ergaben eine vielversprechende Aktivität der Energy Coupling Factor Transporter-Inhibitoren K4104497 und HHPS77 gegen Clostridium perfringens im niedrigen μg/mL-Bereich, während das Wachstum anderer Clostridium spp. und C. difficile weniger beeinträchtigt wurde. Die Kenntnis der in Deutschland zirkulierenden C. difficile-Stämme und ihrer AMR-Profile ist aus epidemiologischen und therapeutischen Gründen wichtig. Die Implementierung einer standardisierten, deutschlandweiten Surveillance für C. difficile im deutschen Krankenhausumfeld war daher ein wichtiges Ziel dieser Arbeit, um die zirkulierenden RTs und deren AMR-Profile zu erfassen. Diese Studie ermöglicht es zum ersten Mal, sich ein Bild von der realen C. difficile Situation im klinischen Umfeld zu machen, indem die Verzerrung durch die Krankheitsschwere oder die zufällige Akquisition von Isolaten vermieden wurde. Diese Studie ergab, dass Isolate des HVR RT027 heute im deutschen Gesundheitswesen seltener vorkommen als früher, und dasselbe gilt für den in Deutschland epidemiologisch relevanten RT001, dessen Inzidenz in den letzten Jahren ebenfalls zurückging. MDR wurde auf niedrigem Niveau angetroffen, war aber bei RT027 besonders deutlich, was frühere Befunde stützt, die darauf hindeuten, dass dieses HVR-RT ein wichtiger Treiber für MDR ist. Die Identifizierung der HVR-RTs durch Ribotypisierung oder Ganzgenomsequenzierung ist kostspielig und zeitaufwendig. Um eine kosteneffiziente und schnelle Methode zur zuverlässigen Unterscheidung zwischen HVR-RTs und Nicht-HVR-RTs zu finden, wurde als dritter Teil meiner Dissertation die MALDI-TOF MS in Kombination mit Bioinformatik auf ihre Eignung zur Unterscheidung zwischen den beiden vorgenannten Gruppen getestet. Dabei zeigte sich, dass epidemiologisch relevante, in Europa zirkulierende HVR-RTs, wie die RTs 023, 027, 045, 078, 126 und 176, mit dieser Methode tatsächlich mit einer Genauigkeit von >95% von Nicht-HVR-RTs unterschieden werden konnten, wenn MALDI-TOF-Massenspektren mit einer TICp-basierten Peak-Matrix in Kombination mit den Vorhersagealgorithmen RF (Random Forest) oder PLS-DA (Partial Least Squares-Discriminant Analysis) analysiert wurden. Eine genauere Betrachtung der HVR-RTs ergab, dass einige der HVR-RTs von C. difficile, wie die RTs 023 und 027/176, mit einer Genauigkeit von >94% noch weiter von anderen in Deutschland zirkulierenden HVR-RTs wie den RTs 045, 078, 126 und 127 unterteilt werden konnten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die MALDI-TOF MS ein schnelles und leistungsfähiges Werkzeug sein könnte, um den Arzt darüber zu informieren, ob eine CDI durch ein HVR C. difficile-Isolat verursacht wird, das möglicherweise besondere Aufmerksamkeit erfordert.