Die Proteinkinase CK2 : Ein neuer Regulator des Oberflächenproteins nerve/glial antigen (NG)2

Abstract

Das Proteoglykan nerve/glial antigen (NG)2 wird unter physiologischen Bedingungen unter anderem von Perizyten exprimiert und ist maßgeblich an angiogenen Prozessen beteiligt. Unter pathologischen Bedingungen exprimieren auch einige Subpopulationen von Tumoren, wie das Glioblastoma multiforme (GBM), dieses Proteoglykan, wodurch deren Proliferations- und Migrationsfähigkeit deutlich erhöht ist. Daher ist NG2 ein vielversprechendes Target für neue anti-angiogene und anti-kanzerogene Therapieansätze. Allerdings sind die molekularen Regulationsmechanismen der NG2-Expression bislang weitestgehend unbekannt. Perizyten zählen zu den perivaskulären Zellen, welche in die Basalmembran des Gefäßendothels eingebettet sind und durch ihren direkten Kontakt mit Endothelzellen die Angiogenese regulieren. Weiterhin ist bekannt, dass das Oberflächenprotein NG2 sowohl unter physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen eine pro-angiogene Wirkung hat und der Verlust von NG2 in Perizyten die Angiogenese hemmt. In Endothelzellen konnte bereits mehrfach gezeigt werden, dass die Proteinkinase CK2 angiogene Signalwege reguliert und CK2-Inhibitoren eine anti-angiogene Wirkung ausüben. Daher wurde im 1. Teil der vorliegenden Arbeit untersucht, ob die CK2 auch einen Einfluss auf den NG2-Proteingehalt und die angiogene Aktivität von Perizyten hat. Dazu wurden primäre humane Perizyten mit den CK2-Inhibitoren TBB und CX-4945 sowie siRNAs gegen die katalytische CK2α- und CK2α‘-Untereinheit behandelt und der Proteingehalt sowie die Genexpression von NG2 detektiert. Zudem wurde die putative NG2-Promotorregion und der Effekt einer CK2-Inhibition auf deren transkriptionelle Aktivität mittels Reportergen- und in silico-Analysen untersucht. Abschließend wurden die Auswirkungen einer CK2-Inhibition auf die angiogene Aktivität von Perizyten in vitro mittels scratch, sprouting, transmigration und tube formation assay sowie ex vivo mittels aortic ring assay und in vivo mittels matrigel plug assay analysiert. Sowohl eine Inhibition als auch ein knockdown (KD) der CK2 in Perizyten reduzierten den Proteingehalt von NG2 signifikant. Durch die Analysen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die CK2 die Genexpression von NG2 reguliert und in der NG2-Promotorregion Bindestellen von CK2-abhängigen Transkriptionsfaktoren lokalisiert sind. Sowohl in vitro, ex vivo als auch in vivo konnte in Folge der Reduktion des NG2-Proteingehalts nach CK2-Inhibition eine signifikante Reduktion von angiogenen Prozessen beobachtet werden. Folglich konnte die CK2 als neuer Regulator der NG2-Expression und der angiogenen Aktivität von Perizyten identifiziert werden. Im 2. Teil der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob eine CK2-Inhibition auch in humanen GBM-Zellen die NG2-Expression reduziert. Dazu wurden die beiden humanen GBM-Zelllinien A1207 und U87 mit CX-4945 behandelt sowie zusätzlich mittels CRISPR/Cas-Methode ein CK2α-knockout (KO) generiert und der Proteingehalt und die Genexpression von NG2 detektiert. Zudem wurde der Effekt einer CK2-Inhibition auf die transkriptionelle Aktivität der putativen NG2-Promotorregion mittels Reportergen-Analysen untersucht. An Hand von scratch und transmigration assay wurde der Effekt einer CK2-Inhibition auf die Proliferations- und Migrationsfähigkeit der Zellen untersucht. Mit Hilfe der Plattform cBioPortal wurde in silico die Expression von NG2 und den CK2-Untereinheiten in Patientenproben aus Gliomen und GBMs analysiert. Abschließend wurden primäre Zellen aus humanen GBM-Tumoren mit dem CK2-Inhibitor CX-4945 behandelt und der NG2-Proteingehalt untersucht. Eine Inhibition und ein KO der CK2 in humanen GBM-Zellen reduzierten den Proteingehalt von NG2 signifikant. Es konnte auch für GBM-Zellen nachgewiesen werden, dass die CK2 über einen genregulatorischen Mechanismus NG2 reguliert. Zudem war die Proliferation und Migration in Folge eines reduzierten NG2-Proteingehalts nach CK2-Inhibition signifikant reduziert. Die Expression von NG2 und den CK2-Untereinheiten waren in GBMs im Vergleich zu anderen Gliomen signifikant erhöht. Darüber hinaus wiesen die in silico-Analysen auch auf einen den genregulatorischen Mechanismus zwischen CK2 und NG2 hin. Abschließende Experimente mit Patientenproben bestätigten die Zelllinien-basierten Ergebnisse. Daher kann geschlussfolgert werden, dass die CK2 auch in GBM-Zellen ein wichtiger Regulator der NG2-Expression und der assoziierten Prozesse, wie Migration und Proliferation ist. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass NG2 ein nachgeordnetes Signalmolekül der CK2 ist. Daher könnte der in klinischen Phase I und II Studien befindliche CK2-Inhibitor CX-4945 besonders in NG2-positiven Tumoren, wie dem GBM, auf Grund seiner anti-angiogenen Wirkung im vaskulären Kompartiment und der anti-kanzerogenen Wirkung im Tumorkompartiment einen vielversprechenden Therapieansatz darstellen.

The proteoglycan NG2 is expressed under physiological conditions by pericytes, among others, and is significantly involved in angiogenic processes. Under pathological conditions, some subpopulations of tumors, such as glioblastoma multiforme (GBM), also express this proteoglycan, significantly increasing their proliferation and migration capacity. Thus, NG2 is a promising target for novel anti-angiogenic and anti-carcinogenic therapeutic approaches. So far, the molecular regulatory mechanisms of NG2 expression are largely unknown. Pericytes are perivascular cells that are embedded in the basement membrane of the vascular endothelium and regulate angiogenesis through direct contact with endothelial cells. Furthermore, the surface protein NG2 is known to have a pro-angiogenic effect under both physiological and pathological conditions, whereas loss of NG2 in pericytes inhibits angiogenesis. In endothelial cells, the protein kinase CK2 is known to regulate angiogenic signaling pathways, and CK2 inhibitors exert an anti-angiogenic effect. Therefore, in a first part of this thesis, it was investigated whether CK2 also has an effect on NG2 protein levels and the angiogenic activity of pericytes. For this purpose, primary human pericytes were treated with the CK2 inhibitors TBB and CX-4945 and siRNAs against the CK2α and CK2α' catalytic subunit, and protein levels as well as gene expression were analyzed. In addition, the putative NG2 promoter region and the effect of CK2 inhibition on its transcriptional activity were examined by reporter gene and in silico analyses. Finally, the effects of CK2 inhibition on angiogenic activity of pericytes were analyzed in vitro by scratch, sprouting, transmigration, and tube formation assays as well as ex vivo by aortic ring assays and in vivo by matrigel plug assays. Both inhibition and knockdown (KD) of CK2 in pericytes significantly reduced the protein level of NG2. It was further demonstrated that CK2 regulates NG2 gene expression and that binding sites of CK2-dependent transcription factors are localized in the NG2 promoter region. In vitro, ex vivo and in vivo, a significant reduction of angiogenic processes was observed as a consequence of the reduction of the NG2 protein level after CK2 inhibition. Consequently, CK2 was identified as a novel regulator of NG2 expression and angiogenic activity of pericytes. In a second part of this thesis, it was investigated whether CK2 inhibition also reduces NG2 expression in human GBM cells. For this purpose, the human GBM cell lines A1207 and U87 were treated with CX-4945 and, in addition, a CK2α-knockout (KO) was generated by CRISPR/Cas method and the protein level and gene expression of NG2 were analyzed. Moreover, the effect of CK2 inhibition on the transcriptional activity of the putative NG2 promoter region was investigated by reporter gene analyses. Using scratch and transmigration assays, the effect of CK2 inhibition on cell proliferation and migration was investigated. The cBioPortal platform was used to analyze in silico the expression of NG2 and the CK2 subunits in patient samples from gliomas and GBMs. Finally, primary cells from human GBM tumors were treated with the CK2 inhibitor CX-4945 and NG2 protein levels were examined. Inhibition and KO of CK2 in human GBM cells significantly reduced the protein level of NG2. It was also demonstrated for GBM cells that CK2 regulates NG2 via a gene regulatory mechanism. Moreover, proliferation and migration were significantly decreased as a result of the reduced NG2 protein level after CK2 inhibition. The expression of NG2 and the CK2 subunits were significantly increased in GBMs compared with other gliomas. Moreover, in silico analyses indicated a gene regulatory mechanism between CK2 and NG2. Final experiments with patient samples confirmed the cell line-based results. Therefore, it can be concluded that CK2 is also an important regulator of NG2 expression and associated processes, such as migration and proliferation, in GBM cells. In summary, it could be demonstrated in the present thesis that NG2 is a downstream signaling molecule of CK2. Thus, the CK2 inhibitor CX-4945, which is in phase I and II clinical trials, may represent a promising therapeutic approach, particularly in NG2-positive tumors, such as GBM, due to its anti-angiogenic effect in the vascular compartment and anti-carcinogenic effect in the tumor compartment.