Characterization of RIBEYE knock-in mice to analyze the role of RIBEYE B-domain for the assembly of the synaptic ribbon

Abstract

Ribbon synapses are specialized chemical synapses that transmit a wide range of sensory information in the visual and auditory systems. Ribbon synapses are tonically active and continuously release neurotransmitters at the synapse in response to graded changes of membrane potential. Continuous synaptic transmission at ribbon synapses requires a presynaptic electron-dense specialization, the synaptic ribbon. The synaptic ribbons immobilize a large number of release-ready vesicles near the release site (active zone) to promote continuous exocytosis. It is a large proteinaceous structure anchored to the active zone of ribbon synapses.

The synaptic ribbon mainly consists of the RIBEYE protein (Schmitz et al., 2000). RIBEYE contains a unique amino-terminal RIBEYE A-domain and a carboxy-terminal B-domain. The B-domain of RIBEYE shows sequence identity to the transcriptional co-repressor CtBP2 and binds with NAD(H). NAD(H) regulates the interaction between RIBEYE A- and RIBEYE B-domain (Schmitz et al., 2000; Magupalli et al., 2008). NAD(H) also promotes the assembly of CtBP2 dimers into tetramers (Bellesis et al., 2018). Transfection experiments suggested that the RIBEYE A-domain plays a structural role due to the formation of electron-dense protein aggregates (Magupalli et al., 2008). Consequently, the deletion of the RIBEYE A-domain in RIBEYE knock-out mice has revealed a complete loss of retinal and inner ear synaptic ribbons (Maxeiner et al., 2016; Jean et al., 2018). To date, it is unclear whether the RIBEYE A-domain alone is sufficient for synaptic ribbon formation or whether the RIBEYE B-domain is also required for the assembly of synaptic ribbons.

To address the role of the RIBEYE B-domain in ribbon formation, I analyzed RIBEYE knock-in mice (RBEKI/KI). In these RIBEYE knock-in mice, the RIBEYE B-domain was replaced with the calcium sensor GCaMP3. RBEKI/KI mice contain only the RIBEYE A-domain fused to GCaMP3 and consequently lack the RIBEYE B-domain.

Morphological analysis of RBEKI/KI by immunofluorescence microscopy and transmission electron microscopy (TEM) showed the complete absence of synaptic ribbons in retinal synapses, both in rod and cone photoreceptor synapses in the OPL as well as in ribbon synapses formed by bipolar cell synapses in the IPL. Similarly, synaptic ribbons were completely absent in outer and inner hair cells of the organ of Corti from homozygous RBEKI/KI mice.

In heterozygous RIBEYE knock-in mice (RBEWT/KI), the overall fluorescence intensity of RIBEYE A- and RIBEYE B-domain immunosignals in the outer plexiform layer (OPL) was significantly reduced in comparison to littermate wild-type mice. In contrast, the average number of RIBEYE (RIBEYE A- and RIBEYE B-domain) puncta was unaffected in the OPL. I investigated the reason for the decreased RIBEYE fluorescence intensity in heterozygous RIBEYE knock-in mice by using super-resolution structured illuminated microscopy (SR-SIM) to measure the contour length of synaptic ribbons. Using transmission electron microscopy (TEM) I further assessed the height of synaptic ribbons. Both analyses showed a significant reduction in the size of synaptic ribbons in RBEWT/KI compared to littermate wild-type control mice. Interestingly, I also observed a decreased expression of RIBEYE in heterozygous RBEWT/KI mice by quantitative western blot analyses raising the possibility that the level of RIBEYE expression is important to control the size of the synaptic ribbon.

In the IPL, I observed a similar though slightly differing result. In the inner plexiform layer (IPL) of RBEWT/KI mice, both average RIBEYE fluorescence intensity (RIBEYE A- and RIBEYE B-domain), as well as average RIBEYE puncta, were significantly reduced compared to littermate wild-type control mice. The reduction in IPL RIBEYE puncta was further analyzed by ultrastructural analysis of rod bipolar cell synapses using TEM which showed the absence of synaptic ribbons in RBEKI/KI mice. Thus, the reduction in RIBEYE fluorescence intensity and RIBEYE puncta in the IPL of RBEWT/KI mice could be due to a loss of synaptic ribbons in bipolar cell synapses. Synaptic ribbons in bipolar cell synapses are smaller in size compared to photoreceptor synapses. Therefore, further reduction in ribbon size can more easily lead to the disappearance of synaptic ribbons in bipolar cell synapses than in photoreceptor synapses.

Collectively, the present data showed that the RIBEYE A-domain alone cannot form synaptic ribbons in the retina and inner ear of RIBEYE knock-in mice (RBEKI/KI). Therefore, these findings strongly suggest that the RIBEYE B-domain is essential for the synaptic ribbon formation. Since RIBEYE B-domain also binds to NAD(H), it can be speculated that RIBEYE B-domain forms a tetramer under the control of NAD(H).

Ribbonsynapsen/Bandsynapsen (engl.: ribbon synapse; im deutschen häufig auch als „Bandsynapse“ bezeichnet) sind spezialisierte chemische Synapsen, die ein breites Spektrum sensorischer Informationen im visuellen und akustischen System übermitteln. Ribbonsynapsen sind tonisch aktive Synapsen und setzen an der präsynaptischen Endigung kontinuierlich Neurotransmitter als Antwort auf abgestufte Änderungen des Membranpotentials frei. Die kontinuierliche Neurotransmitterausschüttung mittels Exozytose benötigt auffällige präsynaptische Strukturspezialisierungen, die als Synaptic Ribbons bezeichnet werden. Synaptic Ribbons binden eine große Anzahl von Freisetzungs-bereiten synaptischen Vesikeln und stellen sie der aktiven Zone für eine kontinuierliche Vesikelexozytose zur Verfügung. Der Synaptic Ribbon ist eine große, Protein-dichte Struktur, die an der aktiven Zone der Ribbonsynapse/Bandsynapse verankert ist. Der Synaptic Ribbon besteht im Wesentlichen aus dem Protein RIBEYE, das spezifisch für die Ribbonsynapsen/Bandsynapsen ist (Schmitz et al., 2000). RIBEYE besteht sich aus einer charakteristischen aminoterminalen A-Domäne und einer carboxyterminalen B-Domäne. Die B-Domäne von RIBEYE ist von der Primärstruktur weitgehend identisch mit dem ubiquitär exprimierten transkriptionelle Co-Repressor CtBP2. CtBP2 und die B-Domäne von RIBEYE binden NAD(H). NAD(H) reguliert die Interaktion zwischen RIBEYE A-Domäne und RIBEYE B-Domäne (Magupalli et al., 2008 et al., Schmitz et al., 2000). Außerdem stimuliert NAD(H) die Assemblierung von CtBP2-Dimeren zu Tetrameren (Bellesis et al., 2018). Heterologe Transfektionsexperimente legten nahe, dass die RIBEYE A-Domäne eine wichtige Rolle bei der Ausbildung von elektronendichten Proteinaggregaten besitzt. Diese Befunde deuten auf eine mögliche strukturelle Bedeutung der A-Domäne von RIBEYE hin (Magupalli et al., 2008). Folgerichtig führt das Fehlen der RIBEYE A-Domäne in RIBEYE Knock-out Mäusen zu einem kompletten Verlust der Synaptic Ribbons in der Retina und im Innenohr (Maxeiner et al., 2016; Jean et al., 2018). Bis heute ist allerdings unklar, ob die RIBEYE A-Domäne alleine ausreichend ist, um Synaptic Ribbons entstehen zu lassen, oder ob auch die RIBEYE B-Domäne einen Beitrag für die Assemblierung der Synaptic Ribbons leistet. Um die Rolle der RIBEYE B-Domäne für die Bildung der Synaptic Ribbons zu untersuchen, habe ich RIBEYE Knock-In Mäuse (RBEKI/KI) verwendet. In diesen Knock-in Mäusen wurde die RIBEYE B-Domäne durch den Calcium-sensor GCaMP3 ausgetauscht. RBEKI/KI Mäuse exprimieren anstelle von RIBEYE ein Fusionsprotein, bestehend aus der aminoterminalen RIBEYE A-Domäne, welche mit GCaMP3 fusioniert ist und folglich keine RIBEYE B-Domäne besitzt. Morphologische Untersuchungen der RBEKI/KI Mäuse mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zeigten ein vollständiges Fehlen von Synaptic Ribbons in den Ribbonsynapsen/Bandsynapsen der Retina (sowohl in Stäbchen- und Zapfen-Photorezeptoren in der äußeren plexiformen Schicht, OPL als auch in den Ribbonsynapsen, die von den Bipolarzellen in der inneren plexiformen Schicht, IPL, der Netzhaut gebildet werden). Weiterhin fehlen die Synaptic Ribbons im homozygoten RIBEYE Knock-in (RBEKI/KI) auch in den äußeren und inneren Haarzellen des Innenohrs. In heterozygoten Knock-in Mäusen (RBEWT/KI) war die Intensität der Immunfluoreszenzsignale von RIBEYE A- und B-Domäne in den Photorezeptorsynapsen der OPL signifikant reduziert. Die durchschnittliche Anzahl/Dichte von RIBEYE Signalen (Anzahl der Synaptic Ribbons in der äußeren plexiformen Schicht) war allerdings zwischen Wildtyp-Kontrolle und heterozygoten Knock-In Mäusen unverändert. Die Abnahme der Intensität der RIBEYE Immunfluoreszenzsignale in der OPL von heterozygoten Knock-In Mäusen wurde weiter mittels SR-SIM Mikroskopie (super-resolution structured illuminated microscopy) untersucht, indem die Konturlänge der Synaptic Ribbons mit dieser hochauflösenden Methode bestimmt wurde. Weiterhin wurde die Höhe der Synaptic Ribbons (Ausdehnung des „Bandes“ von der aktiven Zone bis in die Zelle hinein) mittels Transmissionselektronenmikroskopie ausgemessen. Beide Untersuchungen zeigten übereinstimmend eine signifikante Reduktion der Größe der Synaptic Ribbons in Photorezeptorsynapsen von heterozygoten RBEWT/KI Mäusen gegenüber Wildtyp-Kontrollmäusen aus dem gleichen Wurf. Interessanterweise beobachtete ich mit Hilfe von quantitativen Western Blot-Untersuchungen, dass die Menge an exprimiertem RIBEYE Protein in heterozygoten Knock-in-Tieren deutlich geringer war als in Wildtypkontrollen. Dies deutet darauf hin, dass Expressionsspiegel von RIBEYE wichtig für die Steuerung der Größe der Synaptic Ribbons sein könnte. Im Gegensatz zu den Ergebnissen, die in der äußeren plexiformen Schicht beobachtet wurden, zeigten sich in der inneren plexiformen Schicht sowohl die Fluoreszenzintensität als auch die Anzahl/Dichte der fluoreszierenden Signale in heterozygoten RBEWT/KI Mäusen gegenüber Wildtyp-Kontrollmäusen signifikant abgemindert. Die Reduktion der Immunfluoreszenzsignale in der inneren plexiformen Schicht wurde weiter an Stäbchen-Bipolarzellen in homozygoten RBEKI/KI Mäusen ultrastrukturell mittels TEM untersucht und festgestellt, dass dort Synaptic Ribbons komplett fehlten. Eine Reduktion der RIBEYE Fluoreszenzintensität und der Anzahl der RIBEYE Immunsignale könnte in heterozygoten RBEWT/KI Mäusen durch die physiologischerweise kleineren Synaptic Ribbons in Bipolarzellsynapsen bedingt sein. Die Ribbons in Bipolarzellen sind deutlich kleiner als in den Photorezeptoren. Folglich könnte daher eine weitere Reduktion der Ribbongröße in Bipolarzellen leichter zu einem kompletten Verlust der Synaptic Ribbons führen als in den Photorezeptoren. Zusammenfassend zeigen die hier präsentierten Daten, dass die Ausbildung von Synaptic Ribbons in der Netzhaut und im Innenohr nicht allein durch die RIBEYE A-Domäne bewerkstelligt werden kann. Die A-Domäne ist ja noch in RIBEYE Knock-in (RBEKI/KI) Mäusen vorhanden, die keine Synaptic Ribbons ausbilden. Meine Ergebnisse zeigen, dass die RIBEYE B-Domäne ebenfalls für die Ausbildung der Synaptic Ribbons essenziell ist. Ohne die Anwesenheit der B-Domäne von RIBEYE kommt es zu keiner Ausbildung von Synaptic Ribbons. Die Bindung von NAD(H) an die RIBEYE B-Domäne führt wahrscheinlich zu oligomeren Komplexen (Tetrameren), die möglicherweise verschiedene RIBEYE Untereinheiten zusammenhalten und damit die Ausbildung der Synaptic Ribbons ermöglichen.