The effect of Ca2+ supplementation on epithelial cell differentiation and retinoic acid signaling components in a siRNA-based aniridia cell model

Abstract

Purpose: PAX6 haploinsufficiency related aniridia is characterized by progression of aniridia related eratopathy (ARK) and is associated with disorder of limbal epithelial cells (LECs). PAX6 is expressed in mature corneal and conjunctival epithelial cells of healthy subjects. Screening of aniridia patients’ limbal and conjunctival epithelial cells, deregulated mRNAs of RA signaling components ADH7, RDH10, ALDH1A1, ALDH3A1, STRA6, CYP1B1, RBP1, CRABP2, FABP5, PPARG, VEGFA and ELOVL7 were identified. Changes at mRNA level are detected prior changes at protein level in undifferentiated primary LECs. While combining a small interfering RNA (siRNA) based aniridia cell model (PAX6 knock down) with a differentiation triggering growth condition, we aimed to visualize the expression of differentiation markers at mRNA and protein level. Methods: Primary LECs were isolated from corneoscleral rims of healthy donors and were cultured in serum free low Ca2+ medium (KSFM) and in KSFM supplemented with 0.9 mmol/L Ca2+. In addition, LECs were treated with siRNA against PAX6. All cells were lysed to yield DSG1, PAX6, ADH7, RDH10, ALDH1A1, ALDH3A1, STRA6, CYP1B1, RBP1, CRABP2, FABP5, PPARG, VEGFA and ELOVL7 to get RNA and protein. qPCR using the ΔΔCt method and western blot have been performed to make a comparison at mRNA and protein level. Results: DSG1, FABP5, ADH7, ALDH1A1, RBP1, CRABP2 and PAX6 mRNA expression increased (p≤0.03) while PPARG, CYP1B1 mRNA expression decreased (p≤0.0003) after Ca2+ supplementation. After additional PAX6 knock down, DSG1 and FABP5 protein expression decreased (p≤0.04). FABP5 protein expression increased upon Ca2+ supplementation (p=0.01), DSG1 protein expression was only visible using Ca2+ (p<0.0001). Following PAX6 siRNA treatment, ADH7 and ALDH1A1 were downregulated only at mRNA level under both growth conditions (p≤0.008). Conclusions: Ca2+ treatment can be combined with PAX6 siRNA treatment to mimic aniridia cellular behavior observed in patients. This may be restricted to some of the chosen markers. Upon PAX6 knockdown, mRNA expression of differentiation marker DSG1 and RA component FABP5 decreases. The similar effect becomes apparent at protein level through differentiation triggering Ca2+ treatment in siRNA-based aniridia cell model. In the future, we need to perform further antibody validation for the remaining markers to confirm these findings.

Fragestellung: Die PAX6-Haploinsuffizienz-assoziierte Aniridie ist durch das Fortschreiten der Aniridie-assoziierten Keratopathie (ARK) charakterisiert und in der Regel mit einer Störung der limbalen Epithelzellen (LECs) verbunden. PAX6 wird in reifen kornealen und konjunktivalen Epithelzellen gesunder Personen exprimiert. Beim Screening der limbalen und konjunktivalen Epithelzellen von Aniridie-Patienten wurden deregulierte mRNAs der RA-Signalkomponenten ADH7, RDH10, ALDH1A1, ALDH3A1, STRA6, CYP1B1, RBP1, CRABP2, FABP5, PPARG, VEGFA und ELOVL7 identifiziert. Veränderungen auf mRNA-Ebene wurden vor Veränderungen auf Proteinebene in undifferenzierten primären LECs nachgewiesen. Durch die Kombination eines Small Interfering RNA (siRNA) basierten Aniridie-Zellmodells (PAX6 knockdown) mit einer differenzierungsaus lösenden Wachstumsbedingung wollten wir die Expression von Differenzierungsmarkern auf mRNAund Proteinebene sichtbar machen. Methoden: Primäre LECs wurden aus korneoskleralen Ringen von gesunden Spendern isoliert und in serumfreiem low Ca2+ Medium (KSFM) und in KSFM supplementiert mit 0,9 mmol/L Ca2+ kultiviert. Zusätzlich wurden die LECs mit siRNA gegen PAX6 behandelt. Die RNA und Proteine wurden aus den Zellen isoliert und DSG1, PAX6, ADH7, RDH10, ALDH1A1, ALDH3A1, STRA6, CYP1B1, RBP1, CRABP2, FABP5, PPARG, VEGFA und ELOVL7 mittels qPCR unter Verwendung der ΔΔCt-Methode und Western Blot analysiert, um einen Vergleich auf mRNA und Proteinebene durchzuführen. Ergebnisse: Nach der Ca2+-Supplementierung konnte ein Anstieg der mRNA-Expression von DSG1, FABP5, ADH7, ALDH1A1, RBP1, CRABP2 und PAX6 gemessen werden (p≤0,03), während die mRNAExpression von PPARG und CYP1B1 herunterreguliert wurde (p≤0,0003). Nach zusätzlichem PAX6- Knockdown nahm die DSG1- und FABP5-Proteinexpression ab (p≤0,04). Die FABP5-Proteinexp ression stieg nach Ca2+-Supplementierung an (p=0,01), die DSG1-Proteinexpression war nur mit Ca2+ sichtbar (p<0,0001). Nach der PAX6 siRNA-Behandlung wurden ADH7 und ALDH1A1 nur auf mRNAEbene unter beiden Wachstumsbedingungen herunterreguliert (p≤0,008). Schlussfolgerungen: Die Ca2+-Behandlung kann mit der PAX6 siRNA-Behandlung kombiniert werden, um das bei Patienten beobachtete zelluläre Verhalten der Aniridie zu imitieren. Dies kann auf einige der ausgewählten Marker beschränkt sein. Nach dem PAX6-Knockdown sinkt die mRNAExpression des Differenzierungsmarkers DSG1 und der RA-Komponente FABP5. Ein ähnlicher Effekt zeigt sich auf Proteinebene durch differenzierungsauslösende Ca2+-Behandlung im siRNA-basierten Aniridie-Zellmodell. In Zukunft müssen weitere Antikörper-Validierungen für die übrigen Marker durchgeführt werden, um die Ergebnisse zu bestätigen.