Regulation der CXC-Chemokinfamilie durch die miR-34a-5p

Abstract

Chemokine sind eine Untergruppe der Zytokine, die von Immunzellen sezerniert werden, Chemotaxis vermitteln und an der Regulation der Angiogenese beteiligt sind (STRIETER et al., 1995; ZLOTNIK, YOSHIE, 2000). Die microRNA-34a-5p (miRNA/miR) ist eine bekannte Tumorsuppressor-microRNA, deren Expression in vielen Tumoren erniedrigt und in mehreren Immunzellsubsets von Lungenkrebserkrankten gegenüber Gesunden erhöht ist (FUJITA et al., 2008; GALLARDO et al., 2009; HART et al., 2016; LEIDINGER et al., 2014; TAZAWA et al., 2007). Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss der miR-34a-5p auf chemokinvermittelte Signalwege in Immunzellen zu untersuchen. Mittels Microarray von miR-34a-5p transfizierten M1-Makrophagen wurde eine Genexpressionsanalyse durchgeführt. Dabei konnten unter den reprimierten Genen die Chemokine CXCL10 und CXCL11 identifiziert werden. Durch bioinformatische Zielgenvorhersagen für die miR-34a-5p in Kombination mit Signalweganalysen konnten auch in in silico-Analysen die CXC-Chemokinfamilie und deren Rezeptoren als potenzielle Zielgene identifiziert werden. Die Verifikation durch Dual-Luciferase-Assays ergab, dass CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL14, CXCL16 sowie CXCR3 über posttranskriptionelle Repression durch die miR-34a-5p reguliert werden. Durch Western Blots und durchflusszytometrische Analysen konnte die Reduktion von CXCR3 durch miR-34a-5p-Überexpression auf Proteinniveau in CD4+-T-Zellen bestätigt werden. Mit Hilfe von Enzyme-linked Immunosorbent Assays konnte gezeigt werden, dass die Überexpression der miR-34a-5p in M1-Makrophagen eine verringerte CXCL10- und CXCL11-Sekretion zur Folge hat. Die Überexpression der miR-34a-5p in den verschiedenen Immunzellsubsets könnte daher durch eine geringere CXCR3-Expression auf CD4+-T-Zellen zu einer verringerten Differenzierung in TH1-Zellen führen und auf diesem Weg die TH1-vermittelte Immunantwort einschränken. Eine reduzierte CXCL10- und CXCL11-Sekretion führt zu einer geringeren Chemotaxis von T-Zellen, die wie M1-Makrophagen eine Antitumorwirkung ausüben (GENG et al., 2015; OHRI et al., 2009; WELSH et al., 2005; ZHENG et al., 2020). Die Ergebnisse dieser Arbeit legen daher den Schluss nahe, dass die Überexpression der miR-34a-5p in Immunzellen von Tumorpatienten einen Einfluss auf die Antitumorantwort hat.

Chemokines are a subset of cytokines, which mediate chemotaxis and are involved in the regulation of angiogenesis. The microRNA-34a-5p (miRNA/miR) is a well-known tumor suppressor microRNA, whose expression is reduced in many tumors and increased in numerous immune cell subsets of lung cancer patients compared to healthy individuals. The aim of this work was to investigate the influence of miR-34a-5p on chemokine-mediated signaling pathways in immune cells. A gene expression analysis was carried out using a microarray of M1 macrophages transfected with miR-34a-5p. Among the repressed genes, the chemokines CXCL10 and CXCL11 could be identified. Bioinformatic target gene predictions for miR-34a-5p in combination with pathway analysis identified the CXC chemokine family and their receptors as potential target genes in in silico analysis. Performing Dual-Luciferase assays, it could be verified that CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL14, CXCL16 and CXCR3 are regulated by miR-34a-5p via post-transcriptional repression. The miR-34a-5p induced reduction of CXCR3 in CD4+ T cells could be confirmed at protein level by western blots and flow cytometry. Enzyme-linked immunosorbent assays showed that overexpression of miR-34a-5p in M1 macrophages results in a reduced secretion of CXCL10 and CXCL11. High levels of miR-34a-5p in various immune cell subsets could therefore cause a reduced differentiation of CD4+ T cells into TH1 cells due to lower CXCR3 expression, leading to a reduced TH1-mediated immune response. A lower secretion of CXCL10 and CXCL11 hampers the chemotaxis of T cells, which, like M1 macrophages, exert an anti-tumor effect (GENG et al., 2015; OHRI et al., 2009; WELSH et al., 2005; ZHENG et al., 2020). Taken together, the results of this work suggest that overexpression of miR-34a-5p in immune cells of tumor patients influences the anti-tumor response.