Biocompatibility studies for novel therapeutic strategies at the tympanic membrane level

Abstract

Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Anwendbarkeit und dem Nutzen neuartiger Strategien zur Behandlung zweier Ohrpathologien: zum einen der optoakustischen Stimulation des Hörsystems, die zur Behandlung von Hörverlusten eingesetzt werden soll. Zum anderen wurde die Applikation von selbstklebenden Silikonpflastern zum unkomplizierten und direkten Verschluss von Trommelfellperforationen untersucht. Zentraler Applikationsort beider Methoden war dabei das Trommelfell. Das Trommelfell ist ein essenzieller Bestandteil des Hörsystems und spielt eine wichtige Rolle für das Hörvermögen, da es die Schallwellen, die gesammelt durch den äußeren Gehörgang auf die dünne, elastische Membran treffen, aufnimmt und durch diese zum Schwingen gebracht wird, dem ersten Schritt im Hörvorgang. Andererseits fungiert es als Grenzfläche zwischen äußerem Ohr und Mittelohr auch als physiologische Barriere und schützt das Mittelohr vor dem Eindringen von Keimen. Ist das Hörvermögen eines Menschen eingeschränkt, z.B. durch altersbedingte Schwerhörigkeit, kommen Hörsysteme zum Einsatz. Diese dienen der symptomatischen Behandlung des Hörverlustes und sollen somit den Patienten wieder die Teilnahme am Leben ermöglichen. Nachteile der konventionellen Therapie sind allerdings eine geringe frequenzspezifische Auflösung des Eingangssignals mit folgender Differenzierungsstörung trotz ausreichender Verstärkung, geminderter Tragekomfort durch einen Verschluss- und damit verbundenen wiederkehrenden Entzündungen des äußeren Gehörganges usw. Die optoakustische Stimulation bietet eine alternative Stimulationsmethode des Hörsystems mit einer zu erwarteten erhöhten Frequenzauflösung und gleichzeitiger Verbesserung des Tragekomforts, da der Verschluss des Gehörganges bei Nutzen dieser Methode entfallen würde. Dabei werden kurze Laserpulse eingesetzt, um Vibrationen im bestrahlten Gewebe, z.B. dem Trommelfell oder weiteren vibrationsfähigen Komponenten des peripheren Hörsystems, zu erzeugen. Als grundsätzlicher Baustein dieser neuen Stimulationsmethode war ein Ziel dieser Arbeit die Analyse ihrer Biokompatibilität, welche im Tiermodell und in Zellkulturen untersucht wurde. Hierbei konnte am Trommelfell der Maus gezeigt werden, dass für einen gepulsten Laser, mit 532 nm Wellenlänge, ab einer Schwelle von 89 mW mittlerer Laserleistung, Zonen mit apoptotischen und nekrotischen Zellen entstanden, die mit steigender Laserleistung in ihrer Größe zunahmen. Es konnte kein negativer Einfluss auf das Hörvermögen der Tiere durch die Stimulation nachgewiesen werden. In Zellkulturversuchen mit drei humanen Zelllinien konnte gezeigt werden, dass die erhaltenen Schädigungsschwellen je nach Zelllinie deutlich höher waren. Außerdem konnte hier eine reduzierte Zellviabilität nachgewiesen werden, die wiederum abhängig von der Strahlungsintensität war und sich in der Ausprägung zwischen den Zelllinien unterschied. Überdies wurden durch die Bestrahlung regulatorische Prozesse in den Zellen induziert, die sich über Genexpressionsanalysen nachweisen ließen. Das Hörvermögen kann, neben der Altersschwerhörigkeit, auch durch Trommelfellperforationen maßgeblich beeinträchtigt sein. Durch die Perforationen wird die Schallweiterleitung erheblich geschwächt und es entsteht eine Schallleitungsschwerhörigkeit. Des Weiteren können durch die Perforation Keime in das Mittelohr eindringen und dort akute Entzündungen auslösen, die weitreichende Folgen, etwa die Entstehung von chronischen Prozessen und die Bildung von Cholesteatomen, mit sich bringen können. Um eine direkt wirksame Behandlung von Trommelfellperforationen zu ermöglichen, hat die AG um Prof. Dr. Arzt vom Leibniz Institut für Neue Materialien (INM) in Kollaboration mit uns selbsthaftende Silikon-Pflaster zur Abdeckung der Perforationen entwickelt. Diese wurden in zwei verschiedenen Ausführungen, unstrukturiert und mikrostrukturiert, produziert und dienen, neben dem Verschluss, später auch der verbesserten Heilung der verletzten Trommelfelle. Beide Pflaster zeigten sich ex vivo als gut haftend auf dem Trommelfell der Maus. In vivo, im lebenden, narkotisierten Tier, fanden wir signifikant erhöhte Hörschwellen und signifikant reduzierte Distorsionsprodukte otoakustischer Emissionen (DPOAE) nach Induzieren einer Perforation. Das Abdecken der Perforation mit den neuartigen Pflastern erhöhte die DPOAE-Signale signifikant, die Hörschwellen in der Click-ABR (engl. auditory brainstem responses)-Messung wurden hingegen nicht signifikant verbessert. In weiteren Versuchen konnten wir zeigen, dass die Applikation von dickeren Pflastern keine signifikante Verbesserung der DPOAE-Signale mit sich brachte. Das Aufbringen der Pflaster auf das gesunde Trommelfell führte bei der dicken und der dünnen Ausführung zu einer signifikanten Reduzierung der DPOAE-Signale. Zusammenfassend erbrachten beide therapeutische Ansätze vielversprechende Ergebnisse, die zusammen mit weiteren translationalen Untersuchungen, auf einen zukünftigen Einsatz im klinischen Alltag hoffen lassen.

The presented thesis investigated the applicability and benefit of two innovative therapeutic strategies for the treatment of ear pathologies: on one side, the optoacoustic stimulation as an alternative stimulation method for the hearing system affected by hearing loss. On the other hand, the application of self-adhesive silicone patches for the simple and direct coverage of tympanic membrane perforations. The central site of application of both methods thereby was the tympanic membrane. The tympanic membrane, or eardrum, plays an essential role for the hearing function, as it collects incoming sound waves, traveling from the outer ear canal and is thereby set into vibrations, the first step of the hearing process. Furthermore, the eardrum forms the interface between the outer ear and the middle ear and functions as a physiological barrier to protect the middle ear from the entering of pathogenic germs. If the hearing function of people is impaired e.g., by presbycusis, age-related hearing loss, hearing aids are needed. Conventionally, patients get supplied with hearing aids that are meant to compensate the hearing loss symptomatically aiming to enable the patients to participate in everyday life. The main drawbacks of conventional hearing aids are the insufficient frequency resolution of the input signal leading to insufficient auditive discrimination of sounds despite sufficient amplification, discomfort wearing them in the occluded ear canal and because of occlusion, recurrent infections. The optoacoustic stimulation offers an alternative stimulation method with an estimated high frequency resolution and a non-occlusive way of application. Thereby, short laser pulses are used to induce vibrations in irradiated tissues e.g., the tympanic membrane or further vibratory components of the peripheral hearing system. As one basic element of this innovative stimulation method, one major goal of the presented work was the investigation of its biocompatibility that was performed in an animal model and in cell culture experiments. The optoacoustic stimulation at the murine tympanic membrane, with our currently used laser parameters, was demonstrated to be safe up to 89 mW. Areas with apoptotic and necrotic cells could be detected starting at 89 mW and increased in their dimensions with rising laser power. We could not identify any negative effect of the stimulation on the hearing function of these animals. In cell culture assays of three human cell lines, our group noticed significantly higher damage thresholds, depending on the irradiated and analyzed cell line. Furthermore, the cell viability was reduced through irradiation with an intensity that was depending on the irradiation power and the respective cell line. Also, regulatory processes were induced by irradiation in the cells, which were investigated by gene expression analysis. Besides age-related hearing loss, eardrum defects play a crucial role in the loss of hearing function as well. Tympanic membrane perforations significantly affect sound transmission, and a conductive hearing loss occurs. Furthermore, pathogenic germs may enter the middle ear through the perforated membrane, predictably leading to acute inflammations that may cause multiple complications up to chronic inflammatory processes and cholesteatoma formation. To allow a very direct and quick therapeutic method for tympanic membrane perforations, in collaboration with the group led by Prof. Dr. Eduard Arzt from the Leibniz Institute for New Materials (INM), self-adhesive silicone patches have been designed. Two different conformations of these patches have been analyzed and presented in this work. The unstructured and the microstructured patches aimed to cover the perforation and to support the healing process in the future. The patches demonstrated ex vivo good adhesive characteristics on the murine tympanic membrane. In vivo, acute eardrum perforations in anesthetized mice induced significantly increased hearing thresholds and significantly reduced distortion product otoacoustic emissions (DPOAE) signals. Covering the perforation with our patches, significantly increased the DPOAE signals, however, the click-ABR thresholds were not significantly affected. In further experiments, we demonstrated that applying patches with higher thicknesses could not improve the DPOAE signals anymore. Additionally, the application of thin and thick patches on the intact tympanic membrane reduced the DPOAE signals significantly. To sum up, both innovative therapeutic strategies at the eardrum level demonstrated significant positive results warranting further translational work that could introduce them into the daily medical practice.