Molekulare Diagnostik und Charakterisierung von intestinalen Infektionen mit dem Helminthen Strongyloides stercoralis

Abstract

Humane Infektionen mit dem Rundwurm Strongyloides stercoralis verursachen ein breites klinisches Krankheitsspektrum, das von einem asymptomatischen Verlauf bis zu einer lebensbedrohlichen Erkrankung reichen kann. Um die eingeschränkte Sensitivität der herkömmlichen mikroskopischen Techniken zu erhöhen, wurde als molekulare Detektionstechnik eine spezifische real-time Polymerase-Kettenreaktion (PCR) entwickelt, deren diagnostische Genauigkeit im Vergleich zu klassischen mikrobiologischen Methoden zum Nachweis von S. stercoralis und den morphologisch ähnlichen Hakenwürmern in dieser Arbeit untersucht wird. Darüber hinaus wurden real-time PCR Untersuchungen für mikroskopisch S. stercoralis gesicherte Proben durchgeführt und die Resultate mit dem Schweizerischen Tropeninstitut verglichen. In einem weiteren experimentellen Teil wurden Sequenzierungen durchgeführt, um eine molekulare Feincharakterisierung der Strongyloides- positiven Proben anhand von Detektion hypervariabler Regionen des 18S rRNA-Gens zu erreichen. Für diese Untersuchungen standen fixierte humane Stuhlproben, gesammelt im Rahmen verschiedener afrikanischer Forschungsprojekte, zur Verfügung. Die real-time PCR zeigte die höchste Detektionsrate (16.8%), gefolgt von den mikroskopischen Techniken. Dabei wurden 50% der S. stercoralis- Infektionen ausschließlich durch die real-time-PCR als positiv nachgewiesen. Alle Proben, die mikroskopisch positiv auf S. stercoralis getestet wurden, konnten durch die PCR bestätigt werden. Die durchgeführten Sequenzierungen des 18S rRNA-Gens von Strongyloides spp. aus insgesamt 24 PCR-positiven Proben ergaben nur in fünf Fällen eindeutig auswertbare Sequenzen, wobei sich eine 100%-ige Übereinstimmung mit publizierten Sequenzen von S. stercoralis zeigte. Die Sequenzierung waren nur bei Proben erfolgreich, welche bereits mikroskopisch positiv waren und damit eine quantitativ hohe Wurmlast aufwiesen. In dieser Arbeit ließ sich zeigen, dass die eingesetzte PCR sensitiver als mikroskopische und kulturelle Diagnostikverfahren zum Nachweis von S. stercoralis ist und eine sichere Abgrenzung von Infektionen mit morphologisch ähnlichen Helminthen erlaubt. Mittels Sequenzierung des 18S rRNA-Gens kann eine exaktere Differenzierung innerhalb der verschiedenen Strongyloides-Spezies vorgenommen werden, jedoch bedarf diese Methodik noch einer weiteren Optimierung und sollte zukünftig durch Ganzgenomsequenzierungs-Experimente ergänzt werden.

Human infections with the helminth species Strongyloides stercoralis encompass a wide clinical spectrum, ranging from asymptomatic carriage to life-threatening disease. To increase the sensitivity of conventional microscopy new molecular tools, for example the real-time polymerase-chain- reaction has been developed. We compared the diagnostic accuracy of those real-time PCR with microscopy tools for the detection of S. stercoralis and the morphologically similar nematode hookworm. Furthermore, we investigated the inter- laboratory concordance of S. stercoralis-specific real-time PCR in already microscopically tested positive samples in our and a foreign laboratory. In another experimental part of our work we implemented sequencing for more detailed molecular characterization of S. stercoralis stains, which was based on the detection of hypervariable regions of the 18S- rRNA. For the investigation we needed human stool specimens which were collected during various african research projects in the last years. The real-time PCR resulted in higher detection rates (16.8%) as compared to the microscopic techniques. 50% of the S. stercoralis- infections were exclusively detected by the real-time PCR. All samples with positive microscopy were also positive by real-time PCR. The sequencing of the 18S rRNA of 24 samples yielded only 5 clearly evaluable sequences showing 100% agreement with published sequences of S. stercoralis. The sequencing was only successful in samples that were already microscopically positive and thus had a quantitatively high worm load. In this work it could be shown that the used real time PCR is more sensitive than microscopic and cultural diagnostic methods for the detection of S. stercoralis and allows clear discrimination to helminths with similar morphologically. By sequencing the 18S rRNA gene subtyping of different Strongyloides species can be made, but this method needs further optimization and should be complemented in the future by whole genome sequencing experiments.