Differential import of proteins across the mitochondrial inner membrane via the TIM23 Complex

Abstract

Mitochondrial precursor proteins differ in their structure, destination and signal, which facilitates the import process across membranes through translocase complexes. The outer and inner membrane translocase complex, TOM-TIM23 complex imports presequence and sorting signal carrying precursor proteins into the matrix and integrated into the inner membrane, respectively. Matrix import of presequence carrying precursor proteins are performed by the interaction of TIM23 complex and presequence translocase-associated import motor (PAM). Membrane insertion of hydrophobic segments of the precursor proteins via stop-transfer mechanism is supported by the direct physical interaction of Mgr2 to the incoming precursor protein. Various studies are focused on the biogenesis, substrate recognition, import behavior, of the TIM23 complex, whereas comparatively less is explored about the regulatory unit, Tim17. Site-specific photo-crosslinking data suggest that Tim17 and Mgr2 differentially interact with hydrophilic and hydrophobic precursor protein segments within the TIM23 complex. In this study, Tim17 temperature-sensitive (ts) mutants are used to understand how Tim17 and Mgr2 cooperate in the decoding of inner membrane sorting signals and the release of precursor proteins into the phospholipid bilayer. In vitro import experiments performed with radiolabelled precursor proteins are used to observe differential sorting behavior of Tim17. The study shows that Tim17 is involved in the lateral sorting of precursor proteins along with Mgr2. Mgr2 provides stability and rescues the import defect of Tim17 and together opens analogously as a channel towards the inner membrane only for hydrophobic sorting signal carrying precursor proteins. In the second part, cst6 mutants are used to observe import kinetics in response to upregulation of Tim23. The cst6 is one of the transcriptional factors of Tim23, which endures mutation to support the allotropic expression of the mitochondrial gene, ATP9. It is observed that the overexpression of Tim23 displays increased import of mitochondrial precursor proteins as the gain of function mutations.

Mitochondriale Vorläuferproteine unterscheiden sich in ihrer Struktur, ihrem Ziel und ihrem Signal, was den Importprozess über Membranen durch Translokasekomplexe erleichtert. Der Translokasekomplex der äußeren und inneren Membran, TOM-TIM23 Complex, importiert Präsequenz- und Sortiersignale, die Vorläuferprotein tragen, in die Matrix und wird in die innere Membran integriert. Der Matriximport von Präsequenz tragendem Vorläuferprotein wird durch die Wechselwirkung von TIM23 Complex und Präsequenztranslokase-assoziiertem Importmotor (PAM) durchgeführt. Die Membraninsertion von hydrophoben Segmenten des Vorläuferproteins über den Stop-Transfer-Mechanismus wird durch die direkte physikalische Wechselwirkung von Mgr2 mit dem ankommenden Vorläuferprotein unterstützt. Verschiedene Studien konzentrieren sich auf die Biogenese, Substraterkennung und das Importverhalten des TIM23-Komplexes, während vergleichsweise weniger über die regulatorische Einheit Tim17 untersucht wird. Ortsspezifische Photovernetzungsdaten legen nahe, dass Tim17 und Mgr2 unterschiedlich mit hydrophilen und hydrophoben Vorläuferproteinsegmenten innerhalb des TIM23-Komplexes interagieren. In dieser Studie werden temperaturempfindliche (ts) Tim17-Mutanten verwendet, um zu verstehen, wie Tim17 und Mgr2 bei der Decodierung von Sortiersignalen der inneren Membran und der Freisetzung von Vorläuferprotein in die Phospholipid-Doppelschicht zusammenarbeiten. In-vitro-Importversuche mit radioaktiv markierten Vorläuferproteinen werden verwendet, um das unterschiedliche Sortierverhalten von Tim17 zu beobachten. Die Studie zeigt, dass Tim17 zusammen mit Mgr2 an der lateralen Sortierung des Vorläuferproteins beteiligt ist. Das Mgr2 bietet Stabilität und rettet den Importdefekt von Tim17 und öffnet sich zusammen analog als Kanal zur inneren Membran nur für das hydrophobe Sortiersignal, das das Vorläuferprotein trägt. Im zweiten Teil werden cst6-Mutanten verwendet, um die Importkinetik als Reaktion auf die Hochregulation von Tim23 zu beobachten. Das cst6 ist einer der Transkriptionsfaktoren von Tim23, der eine Mutation aushält, um die allotrope Expression des mitochondrialen Gens ATP9 zu unterstützen. Es wird beobachtet, dass die Überexpression von Tim23 einen erhöhten Import von mitochondrialem Vorläuferprotein als Gewinn von Funktionsmutationen zeigt.