Please use this identifier to cite or link to this item: doi:10.22028/D291-34094
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Title: Analysis of tissue specific MIC60 isoforms 1 and 3 in human cells and mice
Other Titles: Analyse der gewebsspezifischen MIC60 Protein Isoformen 1 und 3 in menschlichen Zellen und in Mausgewebe
Author(s): Zimmermanns, Sonja
Language: English
Year of Publication: 2021
Place of publication: Homburg/Saar
DDC notations: 570 Life sciences, biology
610 Medicine and health
Publikation type: Dissertation
Abstract: Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells. They fulfil multiple functions, including metabolism and signalling between other cell organelles. Mitochondria are surrounded by two lipid bilayers, an outer and an inner membrane, that separate the intermembrane space and the matrix. The inner mitochondrial membrane is highly folded and divided into the inner boundary membrane and invaginations termed cristae. They are connected by tube-like membrane structures termed crista junctions, which are generated and stabilised by the mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) complex. The core subunit of the MICOS complex is the subunit MIC60, which stabilises the membrane curvature at crista junctions and forms the connection of inner and outer mitochondrial membrane. In the absence of MIC60, the mitochondrial ultra-structure is disrupted and there is a decrease in crista junction formation and stability. When looking at MICOS complex function, there is a variety of diseases linked to malfunction of MICOS subunits such as Down Syndrome, Parkinson’s disease and epilepsy. Different isoforms of MIC60 have been identified and it has been proposed that different tissue types express different MIC60 isoforms. So far, it is unclear whether those isoforms differ in their biochemical properties. Furthermore, RNA sequencing of patient tissue suffering from familiar dilatative cardiomyopathy revealed mutations of the splicing factor RNA-binding motif protein 20 (RBM20). RBM20 mutation potentially leads to an alternative splicing of the MIC60 gene in cardiomyocytes, resulting in the expression of MIC60 isoform 1 instead of MIC60 isoform 3 in healthy cardiomyocytes. In this thesis, two lines of experiments, one with different mouse tissues and one with human embryonic kidney cells (HEK293T cell) were carried out. First, different mouse tissues were analysed regarding their expression of MIC60 isoforms in healthy brain, heart and skeletal muscle cells. Additionally, different tissues isolated from wild-type and heterogenic RMB20 mutated mice were used to examine the expression of MIC60 isoforms and MICOS complex proteins in heart and brain cells. The difference in MIC60 isoform expression depending on the tissue type and the consequences on protein and complex stability of MIC60 interacting proteins was assessed. The second line of experiments focused on the analysis of MIC60 isoforms 1 and 3 and potential changes in MICOS protein and complex stability using HEK293T cells either expressing MIC60 isoform 1 or isoform 3. Furthermore, MICOS interacting proteins, MIC60 protein-protein interaction and the influence on protein import function were analysed to reveal differences between MIC60 isoform 1 and isoform 3 on the protein level. A tissue specific expression of different MIC60 isoforms was confirmed through the first line experiments. While MIC60 isoform 1 is mainly expressed in brain cells, MIC60 isoform 3 is the dominant variant in heart and skeletal muscle cells. Despite this finding, the protein stability of MICOS 6 complex and MIC60 interacting proteins appears to be similar. Regarding complex stability, there is a decrease of molecular mass of MICOS complex detectable in cells that express MIC60 isoform 3. Surprisingly, the experiments with tissues from WT and RBM20 mutated mice showed no change of isoforms in the heart cells of heterogenic mutated RBM20 mice. Nevertheless, when comparing healthy heart and brain tissues of the WT mice with respect to the expression of MICOS subunits, remarkable differences were detectable. In brain mitochondria, there is almost no expression of MIC19 while the amount of expressed MIC25 is higher than in heart cells. Also, the amount of MICOS interaction partners DNAJC11 and SCL25A46 in brain cells is higher than in heart cells. Thus, it appears that not only MIC60, but other MICOS components and interaction partners show a tissue specific expression as well. To sum it up, there is a tissue specificity of MIC60 isoform 1 and 3 expression shown in mouse tissues. Also because of RNA sequencing of human tissue, this leads to the assumption, that not only in mice but also in other animal cells, different tissue types express different isoforms of MIC60. Tissue specificity was also shown for other MICOS proteins. Even though, a difference in cells expressing MIC60 isoforms 1 and 3 was expected, the analysis of human MIC60 isoforms 1 and 3 in HEK293T cells revealed no difference in the examined protein functions and MIC60 protein interactions. Only the decreased MICOS complex stability in cells expressing MIC60.3 indicates a difference in MIC60 isoform function. A follow-up analysis of the MIC60 isoforms as well as a repeated analysis of RBM20 tissue concerning MIC60 isoforms should be addressed by more detailed experiments in the future. A further focus of interest should be the tissue specificity of different MICOS components and possible changes in mitochondrial function.
Eukaryotische Zellen, die Grundbausteine des menschlichen Lebens, sind zusammengesetzt aus multiplen Zellorganellen. Mitochondrien sind maßgeblich am Zellmetabolismus, der Synthese von ATP und den Signalwegen zwischen Zellorganellen beteiligt. Damit sind sie essenzieller Bestand jeder eukaryotischen Zelle. Die bohnenförmigen Organellen werden von einer Lipiddoppelschicht umrandet. Die äußere und die gefaltete innere mitochondriale Membran grenzen den Intermembranraum und den Matrixraum voneinander ab. Diese Faltung der inneren Membran nennt man Cristae. Das Bindeglied zwischen den Cristae und dem restlichen Teil der inneren mitochondrialen Membran sind tunnelartige Membranabschnitte - Crista Junctions. Diese Crista Junctions werden durch den „mitochondrial contact side and cristae organising system“ (MICOS) Komplex gebildet und ihre Form wird durch den MICOS Komplex aufrechterhalten. Mutationen der einzelnen MICOS Proteine oder Veränderungen des Komplexes führen unter anderem zu Down Syndrom, Parkinson oder auch Epilepsie. Der MICOS Komplex in menschlichen Zellen besteht aus 7 bekannten Proteinen, von denen MIC60 die zentrale Untereinheit des MICOS Komplexes darstellt. MIC60 stabilisiert den MICOS Komplex und ist beteiligt an der Aufrechterhaltung der Cristae. Des Weiteren spielt MIC60 eine entscheidende Rolle bei der Verbindung von innerer und äußerer mitochondrialer Membran. Verschiedene Isoformen von MIC60 konnten genetisch verifiziert werden, und es besteht die Annahme, dass in den Mitochondrien verschiedener Organgewebe unterschiedliche Isoformen exprimiert werden. Ob die Funktion verschiedener Isoformen von MIC60 variiert, ist bisher noch nicht untersucht worden. Die RNA Sequenzierung von Patientenproben mit einer Mutation des RBM20 Splicingproteins zeigte ein alternatives Splicen des MIC60 Gens, was zu einer Expression von MIC60 Isoform 1 anstelle von MIC60 Isoform 3 im menschlichen Herzen führen soll. Mutationen von RBM20 sind verknüpft mit Familiärer Dilatativer Kardiomyopathie. Der Fokus dieser Arbeit liegt auf zwei Experimentreihen, mit dem Ziel, die Expression von verschiedenen MIC60 Isoformen in verschiedenen Organgeweben zu beweisen und mögliche Unterschiede in den Funktionen von MIC60 Isoformen 1 und 3 zu analysieren. Dafür wurde Organgewebe von gesunden Mäusen speziell auf ihre MIC60 Isoformen analysiert und dann MIC60 und MICOS Komplex Proteine des Gewebes von gesunden und RBM20 heterogen mutierten Mäusen verglichen. Die zweite Experimentreihe untersucht HEK293T Zellen, bei denen zuerst die Expression von MIC60 unterdrückt, und danach eine spezifische Expression von MIC60 Isoformen 1 und 3 mit und ohne FLAG-peptid induziert wurde. Diese Zelllinien wurden verwendet, um die Proteinfunktion der MICOS Untereinheiten spezifischer untersuchen zu können. 8 Die durchgeführten Experimente zeigten, dass die Isoformen von MIC60 gewebsspezifisch exprimiert werden. In den Mitochondrien der Mausgehirnzellen findet sich MIC60 Isoform 1. Im Vergleich dazu exprimieren die Mitochondrien in Mausherzen und im Skelettmuskel MIC60 Isoform 3. Die Analyse der verschieden MIC60 Isoformen in HEK293T Zellen zeigte im Vergleich dazu keinen signifikanten Unterschied der MIC60 Isoformen auf Proteinebene. Auffallend war jedoch die Verminderung der Proteinmasse des MICOS Komplexes in Zellen mit MIC60 Isoform 3. In den Mitochondrien der Herzzellen der WT und RBM20 heterogen mutierten Mäusen konnten, anders als erwartet, kein Unterschied in der exprimierten MIC60 Isoform gefunden werden. Der Vergleich von MICOS Komplex Proteinen in den Herz- und Gehirnmitochondrien zeigte eine gewebsspezifische Expression für die Proteinmengen von MIC19, MIC25 und DNAJC11. In den Gehirnzellen zeigte sich eine sehr geringe Expression von MIC19 und im Vergleich dazu eine wesentlich höhere Expression von MIC25. Des Weiteren zeigten sich größere Mengen an exprimierten DNAJC11 und SLC25A46, bekannten Interaktionspartnern des MICOS Komplexes, in Gehirnzellen. Dies führt zu der Annahme, dass nicht nur MIC60 Isoformen, sondern auch andere MICOS Komponenten und Interaktionspartner gewebsspezifisch exprimiert werden. Schlussendlich lässt sich, auch aufgrund von RNA Sequenzierung des MIC60 Proteins in menschlichem Gewebe, vermuten, dass eine gewebespezifische Expression von MIC60 Isoformen nicht nur in verschiedenen Mausgeweben, sondern auch in anderen tierischen und in menschlichem Gewebe stattfindet. Es scheint wahrscheinlich, dass auch die anderen MICOS Komponenten gewebsspezifisch in unterschiedlichen Mengen exprimiert werden. Trotz dieser Gewebsspezifität von MIC60 Isoformen 1 und 3 konnten auf der untersuchten Proteinebene keine Unterschiede in der MICOS Proteinstabilität und Proteininteraktion festgestellt werden. Funktionsunterschiede der MIC60 Isoformen 1 und 3 scheinen dennoch wahrscheinlich, da Zellen, die MIC60 Isoform 3 exprimieren, eine Veränderung der MICOS Komplexstabilität aufweisen. Eine tiefergehende Analyse der Gewebsspezifität der einzelnen MICOS Untereinheiten, speziell auch der MIC60 Isoformen und deren potentielle Funktionsunterschiede, als auch eine erneute Versuchsreihe mit RBM20 mutierten Zellen sollte in Zukunft angestrebt werden.
Link to this record: urn:nbn:de:bsz:291--ds-340942
hdl:20.500.11880/33286
http://dx.doi.org/10.22028/D291-34094
Advisor: van der Laan, Martin
Date of oral examination: 31-May-2021
Date of registration: 6-Jul-2022
Faculty: M - Medizinische Fakultät
Department: M - Medizinische Biochemie und Molekularbiologie
Professorship: M - Prof. Dr. Martin Van der Laan
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