Genetische Strategien zur Untersuchung körperhomöostaste kontrollierender hypothalamischer Zellpopulationen in der Maus

Abstract

The hypothalamus, located in the diencephalon, close to the median eminence (ME) and the pituitary gland controls body homeostasis by the release of hormones and integration of periphery feedback. To orchestrate these body axes, such as the sexually dimorphic hypothalamus-pituitary-gonadal axis (hpg-axis), the hypothalamus consists of numerous cell populations, each expressing a specific repertoire of proteins. The ion channel family of transient receptor potential (TRP) channels is essential for this orchestration and is widely expressed in the body. TRP-expression patterns with cellular resolution are of great interest, especially in the hypothalamus, but detection is challenging due to multiple reasons. TRP channels are membrane-bound proteins, posttranslationally glycosylated and their expression levels are generally rather low. This makes epitope-directed antibody production and detection at the RNA level with cellular resolution diffcult, unfortunately including the hypothalamus. Reporter mice which label these cell populations with a fluorescent marker, are an elegant tool to overcome these caveats. To investigate TRP expression in the hypothalamus and to identify the individual cell type for each TRP channel, I utilized the newly generated TRPM5, TRPM6, TRPV6, TRPA1, TRPML3, TRPC2, TRPC4 and TRPC5 tGFP-reporter mice and iDISCO clearing. TRM5 is expressed in a subpopulation of tanycytes at the floor of the third ventricle, having access to blood-borne cues via processes extended towards diaphragmed endothelial fenestrations, potentially mediating bidirectional communication between the cerebrospinal fluid and the blood. In addition to tanycytes, I identified TRPM5, and also TRPC5 and TRPA1 cells in the pars tuberalis in close contact with blood vessels. Interestingly, TRPV6 is not expressed in the brain, whereas TRPM6 was found in every blood vessel of the blood brain barrier (BBB). TRPC4 was identified in pericytes, wrapping their processes around blood vessels and tGFP expression was found in fibers in the ME of TRPC2 reporter animals. These fibers are in close contact with fenestrated blood vessels in the posterior ME, indicating that these fibers terminate here. I identified the origin of these fibers in acutely TRPC2 expressing neurons in the paraventricular nucleus (PVN), projecting ventro-latterally into the ME. A subset of these neurons co-express corticotropin-releasing-hormone (CRH), but ablation or silencing of TRPC2 neurons did not have an effect on adrenocorticotropin (ACTH) levels. Activation of TRPC2 neurons resulted in increased luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH) levels. This shows a potential role of TRPC2 neurons in mediating hormone release in the ME. The hpg-axis is controlled by sex steroids, such as oestrogen, in a sexually dimorphic manner. The rate-limiting enzyme for oestrogen synthesis is aromatase. To gain a better understanding how oestrogen impacts sexual differentiation, I investigated aromatase expression through embryonic and prenatal development. To address this question, I capitalized on a Cre reporter mouse which labels aromatase cells with tGFP. Aromatase neurons were first visible at embryonic day 13.5 (E13.5) and dramatically increased in number by E16.5. At birth I revealed a prominent sexual dimorphism in the arcuate nucleus (Arc). Here, aromatase is only expressed in male animals. The majority of oestrogen receptor (ER)-expressing neurons were devoid of aromatase. This indicates that aromatase neurons can convert gonadal and/or brainborn testosterone to oestrogens to regulate neuron activity via ER-dependent paracrine mechanisms. To test this hypothesis we collaborated with the group of Prof. Erik Hrabovszky to perform whole-cell-patch-clamp experiments on kisspeptin neurons in the Arc. These neurons are oestrogen sensitive and are not co-expressing aromatase. Testosterone reduced kisspeptin neuron firing by ~50% and bath application of the aromatase inhibitor Letrozole or the ER-inhibitor ICI182780 entirely prevented this effect. My study provides detailed spatio-temporal information on aromatase neuron development and highlights a novel paracrine mechanism whereby aromatase neurons regulate the activity of distinct neuronal populations expressing ERs.

Der Hypothalamus, lokalisiert im Diencephalon in der N¨ahe der Eminentia mediana (ME) und der Hypophyse, steuert die K¨orperhom¨oostase und die Fertilit¨at durch die Freisetzung von Hormonen und die Integration von R¨uckmeldungen aus der Peripherie. Um diese K¨orperachsen, wie die sexuell dimorphe Hypothalamus- Hypophysen-Gonaden-Achse (HPG-Achse), zu koordinieren, besteht der Hypothalamus aus zahlreichen Zelltypen, die jeweils ein spezifisches Repertoire an Proteinen exprimieren. Die Ionenkanalfamilie der Transient- Receptor-Potential (TRP)-Kan¨ale ist essentiell f¨ur diese Koordinierung und ist in zahlreichen Organen exprimiert. Die TRP-Expressionsmuster im Gesamtorganismus, vor allem aber im Hypothalamus, sind von großem Interesse, aber zuverl¨assige Daten mit zellul¨arer Aufl¨osung fehlen aus unterschiedlichen Gr¨unden. TRP-Kan¨ale sind in der Membran lokalisiert, werden posttranslational glykosyliert und zeigen in der Regel ein eher niedriges Expressionsniveau. Dies erschwert die epitopgerichtete Antik¨orperproduktion und den Nachweis auf RNAEbene, gerade auch im Hypothalamus. Reporterm¨ause, die diese Zellpopulationen mit einem Fluoreszenzfarbsto markieren, k¨onnen genutzt werden, um diese Schwierigkeiten zu umgehen. Um die TRP-Expression im Hypothalamus zu untersuchen und f¨ur jeden TRP-Kanal die spezifischen Zelltypen zu identifizieren, habe ich die neu generierten TRPM5- TRPM6-, TRPV6-, TRPA1-, TRPML3-, TRPC2-, TRPC4- und TRPC5- GFP Reporterm¨ause und iDISCO-Clearing verwendet. Eine Subpopulation von Tanyzyten im dritten Ventrikel exprimiert TRPM5 und stehen potenziell im bidirektionalen Austausch mit dem Blutkreislauf ¨uber ihre Fasern welche in Richtung der fenestrierten Endothelzellen in der ME projizieren. Zus¨atzlich zu den Tanyzyten identifizierte ich TRPM5 sowie TRPC5- und TRPA1 Zellen in der Pars tuberalis in engem Kontakt mit Blutgef¨aßen. Interessanterweise wird TRPV6 nicht im Gehirn exprimiert, w¨ahrend TRPM6 in jedem Blutgef¨aß der Blut- Hirn-Schranke zu finden ist. TRPC4 wurde in Perizyten identifiziert, welche ihre Fasern um Blutgef¨aße wickeln, und GFP-Expression wurde in Fasern in der ME von TRPC2-Reporter Tieren gefunden. Diese Fasern stehen in engem Kontakt mit fenestrierten Blutgef¨aßen im posterioren Teil der ME, was darauf hindeutet, dass diese Fasern hier terminieren. Diese Fasern haben ihren Urpsrung in akut TRPC2 exprimierenden Neuronen im paraventrikul¨aren Nukleus (PVN), die ventro-lateral in die ME projizieren. Eine kleine Subpopulation dieser Neurone exprimiert ebenfalls Corticotropin-Freisetzendes-Hormon (CFH), aber Ablation oder synaptisches silencing von TRPC2 Neuronen hatte keinen Einfluss auf den Adrenocorticotropin (ACTH)-Spiegel. Die Aktivierung von TRPC2 Neuronen f¨uhrte zu erh¨ohten luteinisierendem Hormon (LH) und follikelstimulierendem Hormon (FSH) Spiegeln. Dies deutet auf eine m¨ogliche Rolle der TRPC2 Neuronen bei der Regulation der Hormonfreisetzung in der ME hin. Die HPG-Achse wird durch Sexualhormone, wie z. B. O¨ strogen, in sexuell dimorpher Weise gesteuert. Das geschwindigkeitsbestimmende Enzym fu¨r die O¨ strogensynthese ist Aromatase. Um zu verstehen, wie O¨ strogen die sexuelle Di erenzierung beeinflusst, habe ich die Aromatase- Expression w¨ahrend der embryonalen und pr¨anatalen Entwicklung untersucht. Hierzu nutzte ich ebenfalls eine Cre-Reportermaus, die die Aromatasezellen mit GFP markiert. Aromataseneurone waren erstmals am Embryonaltag 13,5 (E13,5) sichtbar und nahmen bis E16,5 in ihrer Anzahl dramatisch zu. Bei der Geburt zeigte sich ein ausgepr¨agter sexueller Dimorphismus im Nucleus arcuatus (Arc). Hier wird Aromatase nur in m¨annlichen Tieren exprimiert. Die Mehrheit der O¨ strogenrezeptor (O¨ R) exprimierenden Neurone ist Aromatase negativ. Dies deutet darauf hin, dass Aromataseneurone entweder in den Gonaden oder im Gehirn synthetisiertes Testosteron in O¨ strogen umwandeln ko¨nnen, um die Neuronenaktivita¨t u¨ber O¨ R-abha¨ngige parakrine Mechanismen zu regulieren. Um diese Hypothese zu testen, haben wir in Zusammenarbeit mit der Gruppe von Prof. Erik Hrabovszky wholecell-Patch-Clamp Experimente an Kisspeptin Neuronen im Arc durchgef¨uhrt. Diese Neurone sind ¨ostrogen-sensitiv und Aromatase-negativ. Testosteron reduzierte die Erregbarkeit der Kisspeptin- Neuronen um 50% und die Applikation des Aromatase-Inhibitors Letrozol oder des O¨ R-Inhibitors ICI182780 verhinderte diesen E ekt vollst¨andig. Meine Ergebnisse liefern detaillierte r¨aumlich-zeitliche Informationen ¨uber die Entwicklung von Aromatase-Neuronen. Außerdem heben sie einen neuartigen parakrinen Mechanismus hervor, durch den Aromataseneurone die Aktivita¨t verschiedener neuronaler Populationen, die O¨ Rs exprimieren, regulieren.