Role of the Low Molecular Weight Protein Phosphatases PtpA and PtpB on Infectivity of Staphylococcus aureus

Abstract

The bacterium, Staphylococcus aureus (S. aureus) is an opportunistic pathogen which can infect a variety of tissues resulting in a wide spectrum of infections ranging from mild cutaneous lesions to serious clinical manifestations such as endocarditis and osteomyelitis. This pathogen is also a common cause of implant-associated infections (IAIs), which are usually difficult to treat. A major characteristic of infections caused by S. aureus is being recurrent and long-standing. This latter characteristic is probably due to the ability of this pathogen to penetrate and survive within different types of cells in the human body including both professional and non-professional phagocytic cells (NPPCs). Many bacterial pathogens that are capable of surviving intracellularly in host immune cells secrete signaling molecules to modulate host cell signaling in order to survive in these cell types. The molecular mechanisms promoting the intracellular survival of S. aureus in professional phagocytes are not fully understood. However, the survival of S. aureus in these immune cells contributes to the dissemination of this pathogen to different body organs during infections using the so-called “trojan-horse delivery system” mechanism. This mechanism is clearly dangerous when macrophages particularly are occupied with viable S. aureus, owing to the mobility and long-living nature of macrophages compared to other immune cells. Across evolution, bacterial pathogens adapt their genomes in order to be able to counteract adverse environmental conditions during infections. Post-translational modifications (PTMs) of proteins are common mechanisms used by bacterial pathogens to modulate their immune evasion strategies. One common PTM mechanism utilized by many bacterial pathogens is phosphorylation/dephosphorylation of bacterial and host proteins. S. aureus is known to use this reversible phosphorylation of proteins to modulate metabolic processes and the activity of diverse global regulators, however its relation to staphylococcal pathogenesis is not fully characterized and asks for further investigation. This thesis focuses on the characterization of potential roles of two low molecular weight protein phosphatases on the infectivity of S. aureus. These two proteins are called PtpA (Protein tyrosine phosphatase A) and PtpB (Protein tyrosine phosphatase B). Both these phosphatases were not fully characterized in S. aureus till the beginning of this study, despite the fact that homologues for both proteins have been already reported to promote infectivity of pathogens such as Mycobacterium tuberculosis (Mtb), Salmonella typhimurium (S. typhimurium), or Yersinia spp. By studying the impact of these proteins on the interactions of S. aureus with host cells, especially macrophages, it became clear that both, PtpA and PtpB, play important roles in pathogenesis of S. aureus by enhancing the bacterium’s ability to survive inside macrophages. Both proteins also promoted the in vivo infectivity of S. aureus in a mouse model of infection. Moreover, a number of intracellular host proteins were identified as putative binding candidates for PtpA after being secreted inside macrophages during infections. Importantly, the protein Coronin-1A was phosphorylated on tyrosine residues when macrophages were infected with S. aureus. This protein is a crucial component of the cytoskeleton of highly motile host cells and is implicated in various immune-mediated responses. Thus, PtpA could be identified as a tyrosine phosphatase secreted by S. aureus to promote the intramacrophage survival capacity of this pathogen during infections, presumably by interacting with intracellular host proteins including Coronin-1A. In the second half of this study, i investigated the impact of a ptpB deletion on the stress response and infectivity of S. aureus. Here, i observed that this protein arginine phosphatase (PAP) is also required for the intracellular survival of S. aureus inside human macrophages. Subsequent analyses revealed that the phosphatase activity of PtpB in S. aureus is modulated by the oxidative status of the bacterial cell. When mimicking different kind of stresses encountered by S. aureus upon engulfment by macrophages, i noticed that the deletion of ptpB reduced the capacity of S. aureus to cope with oxidative-, nitrosative- and acidic stress, suggesting that PtpB enhances the intracellular survival capacity of S. aureus inside macrophages by increasing the bacterial fitness against the major stresses generated inside these immune cells to kill the internalized bacterial cells. Additionally, PtpB also exerted a protective effect in S. aureus against phagocytosis by polymorphonuclear leukocytes (PMNs). In this regard, cells of the ptpB mutant displayed additionally a decreased ability to release nucleases, which are important to degrade the Neutrophil Extracellular Traps (NETs) produced by PMNs upon activation. PtpB is also required for the overall proteolytic activity of S. aureus. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) analysis uncovered a modulatory effect of PtpB on the expression of various virulence factor encoding genes including psmα (endocing phenol-soluble module α), aur (encoding aureolysin), nuc (encoding nuclease) and also RNAIII (a regulator of the agr locus). Finally, i found that PtpB is also involved in maintaining the cell wall integrity of S. aureus, presumably by modulating the activity of selected autolysins/regulators involved in cell wall homeostasis.

Der opportunistische Krankheitserreger S. aureus ist dazu imstande, verschiedene Organe/Gewebetypen zu infizieren, und dadurch Infektionen der Haut bis hin zu ernsten klinischen Komplikationen wie Endokarditis, Pneumonie oder Osteomyelitis auszulösen. Dieser Erreger ist zudem ein häufiger Verursacher von Implantat-assoziierten Infektionen, die in der Regel nur schwierig zu behandeln sind. S. aureus-Infektionen sind zudem oft wiederkehrend und chronisch, wobei die letztere Eigenschaft vermutlich auf die Fähigkeit des Pathogens zurückzuführen ist, in verschiedene Wirtszelltypen, wie professionelle und nicht-professionelle Phagozyten inserieren zu können und in ihnen für mehrere Tage zu überleben. Die intrazelluläre Überlebensfähigkeit von S. aureus in diesem Immunzelltyp ist eine wichtige Pathogenese-Eigenschaft dieses Bakteriums, die zur Verbreitung des Bakteriums im Körper des Menschen bis in entfernte anatomische Bereiche beiträgt, ein Mechanismus, der im Englischen als “trojan-horse delivery system” bezeichnet wird. Die molekularen Mechanismen, die die intrazelluläre Überlebensfähigkeit von S. aureus in diesen professionellen Phagozyten erhöhen, sind bisher nicht vollständig aufgeklärt. Für verschiedene andere pathogene Bakterien ist jedoch bekannt, dass sie sich intrazellulär in Immunzellen behaupten können, indem sie dort Signalmoleküle sekretieren, die die Wirtszell-Signalwege so modulieren, dass die internalisierten Bakterienzellen in diesem Wirtszelltyp zu überleben vermögen. Viele dieser Pathogene nutzen dabei post-translationale Modifikationen (PTM) von Proteinen, um ihre Immunevasionsstrategien zu modulieren. Die Phosphorylierung/Dephosphorylierung von Wirtszellproteinen stellt dabei für viele Pathogene eine wichtige Form der PTM dar, die Abwehrmechanismen des Wirtes zu umgehen. Die reversible Phosphorylierung wird auch von S. aureus dazu genutzt, metabolische Prozesse und die Aktivität verschiedener globaler Regulatoren zu steuern. Die Bedeutung dieses PTM Mechanismus für die Infektiosität von S. aureus wurde bisher jedoch nur unzureichend charakterisiert, weshalb weitere Untersuchungen in diesem Bereich wünschenswert sind. Diese Arbeit fokussierte sich daher auf die Charakterisierung zweier Niedermolekulargewichts-Proteinphosphatasen, PtpA und PtpB, hinsichtlich ihrer Rolle während der Pathogenese von S. aureus. Beide Phosphatasen sind in S. aureus schon seit längerem bekannt, wurden bis dato aber noch nicht in Hinblick auf ihre Bedeutung für die Infektiosität von S. aureus untersucht, obwohl für andere pathogene Bakterien wie Mycobacterium tuberculosis (Mtb), Salmonella typhimurium (S. typhimurium) und Yersinia spp. gezeigt werden konnte, dass Homologe der beiden Proteine wichtige Virulenzfaktoren darstellen. Durch meine Untersuchungen konnte ich zeigen, dass sowohl PtpA als auch PtpB wichtige Virulenzfaktoren für S. aureus darstellen, die beide die Überlebenskapazität von S. aureus in Makrophagen steigern und die Virulenz des Pathogens während der Infektion erhöhen. PtpA wird dabei vom Bakterium in das umgebende Milieu sekretiert, um mutmaßlich mit Wirtsfaktoren, wie Coronin-1A zu interagieren. Dieses Protein ist eine wichtige Komponente des Zytoskeletts migrierender Wirtszellen und ebenso für die Immunantwort der Wirtszelle von Bedeutung. Da PtpA auch nach Phagozytose durch Makrophagen innerhalb der Wirtszelle sekretiert wird, liegt die Vermutung nahe, dass auch S. aureus durch die Sekretion dieser Protein-Tyrosin-Phosphatase das intrazelluläre Überleben der Bakterienzelle innerhalb der Immunzelle fördert. In Einklang mit dieser Hypothese konnte in Untersuchungen mit einem S. aureus-basierten Leberabszessmodell der Maus gezeigt werden, dass PtpA für die in vivo Infektiosität von S. aureus von großer Bedeutung ist. Im zweiten Teil meiner Promotion beschäftigte ich mich mit der Protein-Arginin-Phosphatase PtpB. Ebenso wie PtpA fördert PtpB das intrazelluläre Überleben von S. aureus in Makrophagen, anders als PtpA wird diese Phosphatase von S. aureus jedoch nicht in das umgebende Milieu sekretiert, sondern übt ihren regulatorischen Einfluss innerhalb der Bakterienzelle aus. PtpB scheint dabei die Fähigkeit von S. aureus zu fördern, mit Stressbedingungen, wie sie im Phagolysosom von Makrophagen nach Aufnahme von Cargo anzutreffen sind, umzugehen. So verminderte die Deletion von ptpB in S. aureus die Fähigkeit des Bakteriums, mit oxidativem-, nitrosativem- oder Säurestress umzugehen. Weiterführende Untersuchungen zeigten zudem, dass die Protein-Arginin-Phosphatase auch eine protektive Rolle für S. aureus, der Phagozytose durch polymorphkernige Leukozyten (PMNs) zu entgehen, einnimmt. Ebenso förderte PtpB die Sekretion von extrazellulären Nukleasen, einem weiteren wichtigen Immunevasionsmechanismus von S. aureus, den von Neutrophilen gebildeten extrazellulären Netzen zu entgehen. Zusätzlich unterstützte PtpB die proteolytische Aktivität von S. aureus und dessen Widerstandsfähigkeit gegenüber lytischen Agenzien wie Triton X-100 oder Lysostaphin. Darüber hinaus konnte ich zeigen, dass PtpB die Transkription von verschiedenen, für Virulenzfaktoren kodierende Gene beeinflusst, darunter psmα (codiert für die phenollöslichen Moduline α1-4), aur (codiert für die Proteinase Aureolysin), nuc (codiert für die Nuklease 1) und RNAIII (eine regulatorische RNA und Masterregulator des agr Lokus). Last not least zeigte eine ptpB Deletionsmutante in dem S. aureus-basierten Leberabszessmodell der Maus eine deutlich verminderte Fähigkeit, vier Tage nach Infektion eine erhöhte Bakterienlast in der Leber und in den Nieren hervorzurufen, und unterstreicht damit die hohe Bedeutung auch dieser Phosphatase für die Virulenz von S. aureus.