Role of the SNARE protein VAMP2 and the SNARE regulatory protein Complexin II in Ca2+ triggered exocytosis

Abstract

Regulated exocytosis of secretory cells is a calcium-dependent process that enables the release of neurotransmitter-storing vesicles. The major proteins involved in exocytosis are the SNAREs (soluble N-ethylmaleimide sensitive factor attachment protein receptor), which provide the essential energy for the actual membrane fusion through their membrane-bridging interactions. Since SNARE proteins assemble spontaneously, regulatory proteins such as Complexin (Cpx) are required to regulate complex formation. In this work, we investigated how transmembrane domains (TMD) of different v-SNARE variants and membrane curvature-mediating lipid molecules affect membrane fusion. In addition, the regulatory roles of the C-terminal domain (CTD) as well as the accessory alpha-helix (AH) domain of Cpx II were investigated. The first part of this work shows that two different naturally occurring v-SNARE TMD variants (responsible for secretion of different sized vesicles) support initiation and extent of granule exocytosis in the same manner as wild-type (wt) protein, a finding that is distinct from the differential effect of TMD variants on the membrane fusion process itself. Moreover, the results show that intracellular application of lipid molecules such as oleic acid (OA, negative curvature mediating) or lysophosphatidylcholine (LPC, positive curvature mediating) enhance or decrease secretion, respectively. This observation can be well explained by the existence of a lipid-based fusion intermediate in the exocytosis of chromaffin granules. The second part of this work addresses the role of the SNARE regulatory protein Cpx II. Previous findings suggested that Cpx II assumes opposing functions in the control of exocytosis, acting as an inhibitor but also as a promoter of exocytosis. Thus, it inhibits premature vesicle exocytosis at submicromolar Ca2+-concentrations, thereby enhancing the assembly of a pool of exocytosis-competent vesicles for synchronous secretion. In the present work, we demonstrated that the last 34 amino acids of the CTD of Cpx II are responsible for preventing premature vesicle secretion. Moreover, electrophysiological experiments show that a Cpx II:SNAP25-SN1 chimera is able to restore Cpx II function, suggesting that Cpx II competes with SNAP-25 for binding to the other SNARE proteins, thus preventing the progressive ‘zipping’ of partially-assembled SNARE complexes. In addition, we examined several interesting point mutations in the C-terminal domain to better understand the role of this region. Finally, the results show that also, the accessory α-helix of Cpx II partially inhibits premature vesicle exocytosis. Overall, these results demonstrate that both the C-terminus and the accessory α-helix are required for inhibition of premature vesicle exocytosis

Die regulierte Exozytose sekretorischer Zellen ist ein calciumabhängiger Prozess, der die Freisetzung von Neurotransmitter-speichernder Vesikel ermöglicht. Die wichtigsten an der Exozytose beteiligten Proteine sind die SNAREs (soluble N-ethylmaleimide sensitive factor attachment protein receptor), die durch ihre membran-verbindenden Interaktionen die wesentliche Energie für den eigentlichen der Membranverschmelzung liefern. Da SNARE-Proteine spontan assemblieren, werden regulatorische Proteine wie Complexin benötigt, um die Komplexbildung zu regulieren. In dieser Arbeit untersuchten wir, wie Transmembrandomänen (TMD) unterschiedlicher v-SNARE-Varianten und Membrankurvatur-vermittelnde Lipidmoleküle die Membranfusion beeinflussen. Darüber hinaus wurde die regulatorische Rolle der C-terminalen Domäne (CTD) sowie der akzessorischen Alpha-Helix (AH) Domäne von Complexin II (CpxII) untersucht. Der erste Teil dieser Arbeit zeigt, dass zwei verschiedene natürlich vorkommende v-SNARE TMD-Varianten (die für die Sekretion unterschiedlich großer Vesikel verantwortlich sind) Auslösung und Ausmaß der Granulenexozytose Fusion in gleicher Weise wie das Wildtyp-Protein (wt) unterstützen, ein Befund, der sich von der unterschiedlichen Wirkung der TMD-Varianten auf den eigentlichen Membranfusionsvorgang unterscheidet. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, dass die intrazelluläre Applikation von Lipidmolekülen wie der Ölsäure (OA, negative Kurvatur vermittelnd) oder des Lysophosphatidylcholins (LPC, positive Kurvatur vermittelnd) die Sekretion verstärken bzw. verringern. Diese Beobachtung lässt sich gut mit der Existenz eines Lipid-basierten Fusionsintermediates in der Exozytose chromaffiner Granulen erklären. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Rolle des SNARE-Regulatorproteins Cpx II. Bisherige Befunde legen nahe, dass CpxII gegensätzliche Funktionen in der Kontrolle der Exozytose übernimmt und zum einen als Inhibitor aber auch als Promotor der Exozytose wirkt. . So hemmt es die vorzeitige Vesikelexozytose bei submikromolaren Ca2+-Konzentrationen und verstärkt somit den Aufbau eines Pools exozytose-kompetenter Vesikel für die synchrone Sekretionsantwort. In der vorliegenden Arbeit konnten wir nachweisen, dass die letzten 34 Aminosäuren der CTD von Cpx II für die Verhinderung der vorzeitigen Vesikelsekretion verantwortlich sind. Darüber hinaus zeigen elektrophysiologische Experimente, dass eine Cpx II: SNAP25-SN1-Chimäre in der Lage ist, die Funktion von Cpx II wiederherzustellen. Diese Beobachtung legt nahe, dass Cpx II mit SNAP-25 um die Bindung an die anderen SNARE-Proteine konkurriert und so die fortschreitende Verbindung partiell-assemblierte SNARE Komplexe verhindert. Darüber hinaus haben wir mehrere interessante Punktmutationen in der CTD untersucht, um die Rolle dieser Region besser zu verstehen. Schließlich zeigen die Resultate, dass die auch AH von Cpx II die vorzeitige Vesikelexozytose teilweise hemmt. Insgesamt demonstrieren diese Ergebnisse, dass sowohl der C-Terminus als auch die akzessorische - Helix für die Hemmung der vorzeitigen Vesikelexozytose erforderlich sind.