Immunhistochemischer Nachweis des nicht-selektiven Kationenkanals TRPC6 im Skelettmuskelgewebe des Menschen

Abstract

Hintergrund: Die im Plasmalemm bzw. Sarkolemm gelegenen TRPC6-Kanäle stellen nicht-selektive Kationenkanäle der TRP-Familie dar, die vor allem eine Permeabilität für das bivalente Calcium-Ion aufweisen. Ihr Vorkommen konnte bislang in tierischen, aber auch in menschlichen Geweben beschrieben werden. Insbesondere beim Menschen scheint TRPC6 eine Rolle bei der Pathophysiologie des ischämischen Schlaganfalls, sowie bei der Alzheimer Erkrankung zu spielen. Aber auch im Prozess der Kanzerogenese einiger Tumorentitäten scheinen sie beteiligt zu sein. Im renalen System wurde eine Assoziation zwischen einer Mutation des Kanals und der sogenannten Fokal-segmentalen Glomerulosklerose beschrieben, bei der es zum Defekt bis hin zum Untergang von Podozyten kommt. Ergebnisse aus tierischen Versuchsreihen zeigten seine wichtige Beteiligung im Prozess der malignen Hyperthermie. Auch im Sarkolemm von Skelettmuskelfasern der Maus konnte das Auftreten der Kanäle gezeigt und deren immense Bedeutung für den Kalziumeinstrom und letztlich für die muskuläre Funktion aufgezeigt werden. Des Weiteren lieferten wissenschaftliche Arbeiten Nachweise bzgl. der Expression von TRPC6 in der glatten Muskulatur des Menschen und dessen wichtige physiologische Bedeutung hinsichtlich der Funktionalität. Basierend auf dieser Grundlage, scheint das Vorhandensein der Kanäle im menschlichen Skelettmuskelgewebe somit nicht unwahrscheinlich. Zum Nachweis von TRPC6 in menschlichem Gewebe und insbesondere auch im menschlichen Skelettmuskelgewebe gibt es bislang kaum Daten. Daher war das Ziel dieser Arbeit, den immunhistochemischen Nachweis von TRPC6 in humanem Skelettmuskelgewebe zu erbringen.

Methoden: Zur Durchführung der Studie wurden acht (n=8) Körperspender eingeschlossen. Die Entnahme der Gewebeproben der fixierten (n=6) und teilweise unfixierten (n=2) Spender realisierte man mittels dermatologischer Stanze und Skalpell aus den Mm. deltoideus, pectoralis major, trizeps brachii und rectus femoris. Aus den gewonnenen Proben konnten letztlich nach mehreren Arbeitsschritten histologische Schnittpräparate angefertigt werden, die dann zunächst zur Beurteilung der Struktur mit Hämatoxylin-Eosin angefärbt wurden. Zur Quantifizierung des Nachweises von TRPC6 im menschlichen Skelettmuskelgewebe wurde folglich die Immunhistochemie genutzt. Dabei kamen ein spezifischer Primärantikörper und ein enzymgekoppelter Sekundärantikörper zur Anwendung. Als Chromogen wurde Diaminobenzidin genutzt. Zur Spezifitätskontrolle wurde einmalig eine Peptidkontrolle durchgeführt, bei der der genutzte Primärantikörper mit einem Kontrollpeptid inkubiert wurde.

Ergebnisse: Der Nachweis von TRPC6 im Skelettmuskelgewebe des Menschen konnte durch die genannte Methodik bestätigt werden. Alle im Rahmen einer Kreuzauswertung untersuchten Proben zeigten in der Immunhistochemie ein positives Signal, wenngleich dieses von unterschiedlicher Intensität war. Die einmalig durchgeführte Peptidkontrolle untermauerte das Ergebnis zudem. Sie führte zu einer deutlich abgeschwächten Bindung des Primärantikörpers an TRPC6.

Schlussfolgerung: Der Nachweis von TRPC6 im humanem Skelettmuskelgewebe konnte mit dieser Arbeit erbracht werden. Das Wissen über das Vorhandensein der Kanäle im Gewebe der humanen Skelettmuskulatur bietet nun die Möglichkeit, die noch ungeklärte Funktion der nicht-selektiven Kationenkanäle hinsichtlich des Muskelstoffwechsels - gemeint ist der Stoffwechsel der humanen Skelettmuskulatur - weiter zu entschlüsseln. Aufgrund seiner allgemeinen Funktion scheint eine Beteiligung bei der Aufrechterhaltung der zellulären Calciumhomöostase nicht unwahrscheinlich. Ebenso könnte TRPC6 - neben seinem physiologischen Beitrag zur Funktionalität - im Rahmen pathophysiologischer Prozesse der Skelettmuskulatur eine bedeutende Rolle einnehmen, beachtet man beispielsweise Studien aus tierischen Versuchsreihen, bei denen dieser Zusammenhang gezeigt werden konnte. Damit könnte TRPC6 möglicherweise als Target pharmakologischer Substanzen dienen, die im Übrigen in anderen Geweben bereits Anwendung finden. Der Zusammenhang zwischen den nicht-selektiven Kationenkanälen TRPC6 und den zahlreichen Erkrankungen der Skelettmuskulatur bleiben zunächst ein unzureichend entschlüsseltes Konstrukt. Es bedarf weiterer wissenschaftlicher Arbeiten, um diese Komplexität zu entschlüsseln.

Background: TRPC6 channels constitute non-selective cation channels that are localized in plasmalemm respectively sarcolemm and have a leading permeability for the bivalent calcium ion. Until now it was found in animal as well as in human tissues. In humans the channel seems to play an important role when it comes to the pathophysiology of cerebral ischemia or Alzheimer´s disease. They seem also to be involved in cancerogenesis. With regard to renal system there are described associations between TRPC6 and the focal segmental glomerulosclerosis that leads to a deficiency or a destruction of podocytes. Furthermore, results of animal experiments could show an involvement of the transient receptor potential channel 6 in a condition known as malignant hyperthermia. In skeletal muscle fibers of mice the expression of TRPC6 in the sarcolemm could be shown. Their enormous importance for the influx of calcium into the muscle cell and thus for the muscular function could also be revealed. Furthermore, some research groups revealed the expression of TRPC6 in human smooth muscle cells and the important role for its function. Based on this foundation the presence of the transient receptor potential channel 6 in human skeletal muscle does not seem unlikely. So far, there is hardly any data on the detection of TRPC6 in human tissue and, in particular, in human skeletal muscle tissue. Therefore, the aim of this work was to provide the immunohistochemical detection of TRPC6 in human skeletal muscle tissue. Methods: For this study eight (n=8) human donors were included. The removal of the tissue was realized by a biopsy punch and a scalpel from the Mm. deltoideus, pectoralis major, trizeps brachii and rectus femoris. The donors were in fixed (n=6) and partially unfixed (n=2) conditions. The samples obtained were processed into histological sections, which were then subjected to Hämatoxylin-Eosin staining. To quantify the detection of TRPC6 in human skeletal muscle tissue we used Immunohistochemistry. Therefore, a primary and an enzyme-linked secondary antibody were used. Diaminobenzidine was used as the chromogenic substrate. In order to specify the result, we processed a peptide incubation of the primary antibody once. Result: The detection of TRPC6 in human skeletal muscle was confirmed by using Immunohistochemistry. All samples examined has shown a positive signal in the IHC, although this was of varying intensity. The peptide control also confirmed the result. The use of the control peptide resulted in a weakened or rather in an absent binding of the primary antibody on the TRPC6 protein. Conclusion: With this research we were able to provide the expression of TRPC6 protein in human skeletal muscle the first time. Based on this foundation following researches may help to understand the unknown function of the non-selective cation channels for the human skeletal muscle metabolism. Its general function suggests that it may be involved in the maintenance of the intracellular calcium homeostasis. Furthermore, they could also be involved in pathophysiological processes as shown in animal experiments. If associations between TRPC6 and muscle diseases could be established, the channels could also serve as a pharmacological target in the future. In summary the association between the transient receptor potential channel 6 and the numerous muscle diseases remain elusive. There are more investigations needed for clarification.