Die anti-angiogene Wirkung und zugrundeliegenden molekularen Mechanismen der microRNAs 370 und 186 sowie der Phytochemikalie Linalool

Abstract

Angiogenese bezeichnet die Entwicklung neuer Blutgefäße aus bereits existierenden Gefäßen. Eine fehlgesteuerte Angiogenese kann mit verschiedenen Krankheiten assoziiert sein, wie z.B. dem Wachstum von Tumoren und deren Metastasierung sowie der Endometriose, Psoriasis oder diabetischen Retinopathie. Deshalb stellt die Inhibition der Angiogenese einen vielversprechenden Ansatz zur Behandlung solcher Erkrankungen dar. Bisher wurden bereits einige anti-angiogene Therapeutika zugelassen. Diese zeigen jedoch geringe Erfolgschancen, da starke Nebenwirkungen auftreten und Tumore Resistenzen dagegen entwickeln können. Daher ist es von großer Bedeutung, neue, effektive anti-angiogene Targets und Medikamente zu identifizieren.

In den letzten Jahren gerieten microRNAs (miRNAs) in den Fokus der Forschung und konnten als bedeutende Regulatoren der Angiogenese beschrieben werden. Daher stellen sie interessante potenzielle Targets für eine anti-angiogene Therapie dar. Andererseits besitzen Phytochemikalien sehr effiziente Eigenschaften und haben dadurch ein hohes Potenzial zur Vorbeugung und Behandlung von Krankheiten. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es deshalb zum einen, miRNAs zu identifizieren, welche die angiogene Aktivität von Endothelzellen regulieren und die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen zu entschlüsseln. Zum anderen sollte die Wirkung der Phytochemikalie Linalool auf die Angiogenese und die zugrundeliegenden intrazellulären Signalwege genauer untersucht werden.

Im ersten Studienabschnitt dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die miRNA-370 ein wirksamer Inhibitor der Angiogenese ist. Eine Transfektion von human dermal microvascular endothelial cells (HDMEC) mit miR-370mimic führte zur Hemmung ihrer Proliferation, Migration, Tube Formation und ihrem Aussprossen aus Sphäroiden. Diese anti-angiogene Wirkung konnte in einem ex vivo Aorten-Ring-Assay und in einem in vivo Matrigel-Plug-Assay bestätigt werden. Im Gegensatz dazu wurden pro-angiogene Effekte durch eine Transfektion mit miR-370inhibitor in vitro und in vivo nachgewiesen. Weitere Untersuchungen zeigten, dass die miR-370 die angiogene Aktivität von Endothelzellen durch direkte Bindung von smoothened (SMO) und bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) hemmt.

Im zweiten Studienabschnitt dieser Arbeit konnte eine deutliche Verringerung der endothelialen miR-186 Expression in humanen, kleinzelligen Adenokarzinomen der Lunge nachgewiesen werden. Außerdem führten hypoxische Bedingungen zu einer Reduktion der miR-186 in Endothelzellen. In weiterführenden in vitro und in vivo Untersuchungen zeigten sich deutliche inhibitorische Effekte der miR-186 auf die Angiogenese. In Tumoren, die aus H460 Zellen und miR-186m-transfizierten HDMEC bestanden, ließ sich zusätzlich ein vermindertes Wachstum und eine erhöhte Apoptoserate feststellen. Mechanistische Analysen konnten eine direkte Bindung der miR-186 an die humane Sequenz der Proteinkinase C alpha (PRKCA) nachweisen, was zu einer Inhibition der Angiogenese führte.

Im dritten Studienabschnitt dieser Arbeit wurde die Wirkung der Phytochemikalie Linalool auf die angiogene Aktivität von Endothelzellen analysiert. Nicht-toxische Konzentrationen von Linalool zeigten hierbei eine deutliche Inhibition der endothelialen Proliferation, Migration und Tube Formation sowie der Aussprossung von HDMEC aus Sphäroiden. Außerdem reduzierte Linalool das Aussprossen aus Aorten-Ringen und die Gefäßdichte in Matrigel-Plugs. Bei den Untersuchungen der zugrundeliegenden molekularen Mechanismen konnte nachgewiesen werden, dass Linalool einerseits die Phosphorylierung der extracellular-signal-regulated kinase (ERK) fördert und die intrazelluläre Adenosintriphosphat (ATP)-Konzentration vermindert. Andererseits aktiviert Linalool den transient receptor potential cation channel subfamily M (melastatin) member 8 (TRPM8), was eine Hemmung der Angiogenese zur Folge hat.

Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass die miR-370 und miR-186 anti-angiogene Funktion auf Endothelzellen haben. Mithilfe der gewonnenen Erkenntnisse über diese beiden intrazellulären Regulatoren könnten zukünftig erfolgsversprechende Therapieansätze zur Inhibition der Angiogenese entwickelt werden. Zusätzlich belegen die Daten der vorliegenden Arbeit, dass Linalool ein vielversprechendes Therapeutikum zur Behandlung Angiogenese-assoziierter Erkrankungen darstellt.

Angiogenesis, the development of new blood vessels from pre-existing ones, essentially contributes to the pathogenesis of various diseases, including cancer, endometriosis, psoriasis and diabetic retinopathy. Accordingly, inhibition of angiogenesis represents a promising approach for the treatment of these diseases. To date, several anti-angiogenic compounds have been approved for the treatment of solid tumors and angiogenesis-related diseases. However, the clinical benefits of these compounds are quite limited due to severe side effects and the onset of drug resistance. Thus, the discovery and development of novel, effective anti-angiogenic targets and drugs is of fundamental interest.

During the last years, microRNAs (miRNAs) have emerged as critical regulators of angiogenesis and are therefore considered as new potential anti-angiogenic targets. On the other hand, phytochemicals represent a rich source of safe and efficient natural compounds that have great potential in disease prevention and treatment. Therefore, the aim of the present thesis was to i) identify miRNAs that regulate the angiogenic activities of endothelial cells and elucidate their molecular mechanisms of function as well as to ii) analyze the effects of the phytochemical linalool on angiogenesis and clarify the underlying mechanisms.

In the first part of this thesis, miR-370 was identified as a potent angiogenesis inhibitor. It was found that overexpression of miR-370 significantly reduces the proliferation, migration, tube formation and spheroid sprouting of human dermal microvascular endothelial cells (HDMEC). These in vitro findings were further confirmed in an ex vivo aortic ring assay and an in vivo Matrigel-Plug assay. In contrast, knockdown of miR-370 resulted in pro-angiogenic effects. Further mechanistic analyses revealed that miR-370 inhibits the angiogenic activity of endothelial cells through directly targeting smoothened (SMO) and bone morphogenetic protein-2 (BMP-2).

In the second part of this thesis, it was found that the expression of endothelial miR-186 is significantly down-regulated in human non-small cell lung cancer (NSCLC) tissue when compared to matched non-tumor lung tissue. Moreover, in vitro experiments have shown that hypoxia leads to a reduced expression of miR-186 in endothelial cells. A panel of in vitro and in vivo angiogenesis assays consistently demonstrated that endothelial miR-186 functions as an efficient angiogenesis inhibitor. Importantly, overexpression of miR-186 in endothelial cells significantly inhibited NSCLC growth and increased the number of apoptotic tumor cells. In addition, mechanistic studies showed that miR-186 inhibits angiogenesis by directly targeting protein kinase C alpha (PRKCA) in endothelial cells.

In the third part of this thesis, the anti-angiogenic effects of the phytochemical linalool on the angiogenic activity of endothelial cells were analyzed. Non-toxic doses of linalool markedly inhibited the proliferation, migration, tube formation and spheroid sprouting of HDMECs. Linalool also efficiently suppressed the sprouting out of rat aortic rings and the vascularization in Matrigel-Plugs. Additional mechanistic analyses revealed that on the one hand linalool inhibits angiogenesis through downregulating the intracellular level of adenosine triphosphate (ATP). On the other hand, linalool activates the transient receptor potential cation channel subfamily M (melastatin) member 8 (TRPM8).

In summary, the results of the present thesis demonstrate that miR-370 and miR-186 exert anti-angiogenic effects on endothelial cells. This may pave the way for the development of novel therapeutic strategies for angiogenesis inhibition based on these intracellular regulators. Moreover, the findings of the present studies indicate that linalool may represent a promising therapeutic agent for the treatment of angiogenesis-related diseases.