Structural and functional investigations to address challenging drug targets

Abstract

The rational development of drugs against diseases such as infections, immunological disorders, cancer, inflammation etc. requires a detailed understanding of the proteins involved in these diseases. This work aims to provide novel insights into such proteins, their structural and dynamic behavior, their modifications and their interactions with small molecules or other proteins to maximize the potential to combat diseases caused by these proteins using rational drug design. This PhD project is subdivided into six projects, each of which focuses on a different protein involved in diseases which has been difficult to interfere with due to a variety of challenging aspects. Project 1 is focused on the bacterial membrane-bound enzyme MraY. Studies on the inhibition of different MraY isoforms in divergent purification systems with muraymycins and muraymycin analogues provided insights into the influence that the experimental conditions have on the investigation of MraY inhibition. Furthermore, the possibility of resistance development through single-point mutations was shown and analyzed. Additionally, a protein-protein interaction between MraY and the soluble enzyme MurF was proven and foundations were laid to understand the structural and biological implications of this interaction. Project 2 revolved around the intrinsically disordered N-terminal and regulatory domains of NFAT. Novel NMR experiments were developed that will improve the analysis of IDPs and the mechanism of subcellular localization of NFAT by phosphorylation was deciphered. Protein dynamics influenced by phosphorylation were analyzed and a basis to solve the structural ensemble of NFAT’s transactivation domain was provided. In addition, a mechanism to control a protein’s function by introduction of binding motifs into IDRs was provided. Project 3 furnished new avenues to target the master regulator for eukaryotic protein translation eIF4E for cancer treatment. An inhibitor targeting a novel cavity was developed and cell-permeable degraders were generated. Also, the structural and functional implications of eIF4E phosphorylation were highlighted by solving the structure of phosphorylated eIF4E. Project 4 aimed to elucidate the specificity in substrate recognition by AHL-synthases of acyl carrier proteins loaded with different cargoes. In project 5, the oligomeric nature of GILZ was shown and experiments were conducted to solve the interface of a GILZ/HDAC7 interaction. Project 6 leveraged the interaction between Keap1 and the transcription factor Nrf2 to develop an open-source software that enabled the largest high-throughput in silico screening possible to date. In addition, experiments were conducted to solve the structure of Keap1 in complex with inhibitors found in those computational screens.

Die rationale Entwicklung von Arzneistoffen gegen Krankheiten wie Infektionen, Immunerkrankungen, Krebs, Entzündungen etc. erfordert ein detailliertes Verständnis der Proteine die an diesen Erkranknungen beteiligt sind. Diese Arbeit versucht neuartige Einblicke in diese Protein zu erzielen, ihr strukturelles und dynamisches Verhalten, ihre Modifikationen und ihre Interaktionen mit kleinen Molekülen und anderen Proteinen um das Potential zu maximieren, Krankheiten, die durch diese Proteine ausgelöst warden, mithilfe von rationalem Arzneistoffdesign zu bekämpfen. Diese Arbeit ist unterteilt in sechs Projekte, von denen jedes auf ein anderes in Krankheiten involviertes Protein fokussiert ist, welches aufgrund verschiedener herausfordernder Aspekte schwer zu untersuchen ist. Projekt 1 behandelt das bakterielle, membranständige Enzym MraY. Studien der Inhibition verschiedener MraY-Isoformen in divergenten Präparationen durch Muraymycine und Muraymycin-Analoga schafften Einblicke in den Einfluss der experimentellen Bedingungen auf die Untersuchung der MraY-Inhibition. Ausserdem wurde die Möglichkeit der Resistenzentwicklung durch Punktmutation gezeigt und analysiert. Darüber hinaus wurde eine Protein-Protein-Interaktion zwischen MraY und dem löslichen Enzym MurF gezeigt, und die Grundlagen zum Verständnis der strukturellen und biologischen Bedeutung dieser Interaktion wurden gelegt. Projekt 2 thematisiert die intrinsisch ungeordneten Transaktivierungs- und regulatorische Domänen von NFAT. Neuartige NMR-Experimente wurden entwickelt, welche die Analyse von IDPs vereinfachten und der Mechanismus der subzellulären Ortsbestimmung von NFAT durch Phosphorylierung wurden entschlüsselt. Die Beeinflussung der Proteindynamik durch Phosphorylierung wurde analysiert und eine Basis zur Erschliessung des strukturellen Ensembles der NFAT-Transaktivierungsdomäne wurde geschaffen. Zusätzlich wurde ein Mechanismus gezeigt, der es ermöglicht, Protein-Funktionen durch Inkorporation von Bindungsmotiven in IDRs zu beeinflussen. Projekt 3 lieferte neue Wege, das Regulatorprotein eukaryotischer Translation eIF4E zu inhibieren. Ein Inhibitor, der eine neue Bindetasche addressiert wurde entwickelt und zellgängige Degradierer wurden generiert. Ausserdem wurden die strukturellen und funktionellen Einflüsse der eIF4E-Phosphorylierung durch das Lösen der Struktur von phosphoryliertem eIF4E gezeigt. Projekt 4 zielte darauf ab, die Spezifität der Substraterkennung von Acyl-Carrier-Proteinen mit verschiedenen Cosubstraten durch AHL-Synthasen zu verdeutlichen. Projekt 5 zeigte den oligmeren Status von GILZ, und Experimente wurden konstruiert, welche die Bindeschnittstelle zwischen GILZ und HDAC7 klar definierten. Projekt 6 nutzte die Interaktion zwischen Keap1 und dem Transkriptionsfaktor Nrf2, um eine Open-Source-Software zu entwickeln, welche das bis dato grösste in silico High-Throughput-Screening ermöglichte. Zusätzlich wurden Experimente durchgeführt, um die Struktur von Keap1 in Komplex mit Inhibitoren, welche in diesem virtuellen Screening gefunden wurden, zu lösen.