Analyse der Loss of Heterozygosity des Chromosoms 1p sowie der Untereinheiten BAF47, BAF45c und BAF250a des ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Komplexes SWI/SNF in Meningeomen

Abstract

Nach der überarbeiteten „WHO classification of tumours of the central nervous system” der Weltgesundheitsorganisation von 2016 wurde der 1p/19q-Status bei Oligodendrogliomen und die IDH-Mutationsanalyse bei Oligodendrogliomen und Glioblastomen zur Diagnosesicherung aufgenommen. Eine ähnliche molekulargenetische Diagnostik ist bei den Meningeomen nicht in den Leitlinien verankert, sodass diese Tumore nur nach ihrer Morphologie eingeteilt werden. Allerdings zeigen diese von den Arachnoidalzellen ausgehenden Tumore mit zunehmender Malignität vermehrt molekulargenetische Alterationen. Bei genetischen Untersuchungen an Meningeomen zeigten sich in etwa 60% der Fälle Chromosomenaberrationen wie (Teil)-Gewinne oder -Verluste. Letzteres wird auch als „Loss of Heterozygosity“ (LOH) bezeichnet und beschreibt den Verlust der physiologischen Heterozygotie der Allele. Dieses Phänomen zeigen am häufigsten die Chromosomen 22q, 1p und 14q in Abhängigkeit vom WHO-Grad. Bei Vorliegen einer LOH auf den genannten Chromosomen weisen die Tumore häufig eine gesteigerte Malignität und ein erhöhtes Rezidivrisiko auf, was die diagnostische Bedeutung dieser molekulargenetischen Aberrationen verdeutlicht. Besonders eine LOH auf dem chromosomalen Abschnitt 1p korreliert dabei mit der klinischen Prognose. Trotz dieser klar identifizierten betroffenen Chromosomenbereiche ist bisher nur bei dem Chromosom 22q das Kandidatengen NF2 als Initiator der Kanzerogenese und der Krankheit „Neurofibromatose 2“ beschrieben. In dieser Studie wurden deshalb weitere mögliche Kandidatengene untersucht, die ihren Genlokus auf den beschriebenen Abschnitten aufweisen und besonders der Chromosomenabschnitt 1p näher betrachtet. Die untersuchten Proteine BAF47, BAF45c und BAF250a sind Teil des Chromatin-Remodeling Komplexes SWI/SNF, dessen Beteiligung bereits in vielen anderen humanen neoplastischen Krankheitsbildern nachgewiesen wurde, wobei besonders BAF250a, auch ARID1A genannt, anteilig als häufigstes mutiert beschrieben wurde. Dadurch ergibt sich einerseits die Frage nach den auslösenden Kandidatengenen der betroffenen Chromosomen, andererseits die Notwendigkeit einer standardisierten molekulargenetischen Diagnostik, die Einfluss auf das Klassifikationssystem der Tumore hat. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu untersuchen, inwieweit die Chromosomenaberrationen Einfluss auf das Expressionslevel verschiedener Proteine zeigen, aber auch inwieweit das klinische Verhalten der Meningeome verändert auftritt. Dieser Fragestellung wurde in einer experimentellen Studie nachgegangen, indem auf DNA- und Proteinebene die beschriebenen Komponenten des SWI/SNF-Komplexes untersucht wurden. An 51 Meningeomproben wurde durch eine PCR-gestützte Mikrosatelliten-Analyse das Vorliegen einer LOH überprüft, während mittels Western Blot und Immunhistochemie die Proteinexpression evaluiert wurde. 7 Durch die sechs angewandten Sonden für Mikrosatelliten konnte ein großer Teil des Chromosoms 1p überprüft werden. Es zeigte sich sehr klar, dass bei einer LOH meist der gesamte überprüfte Chromosomenbereich betroffen ist, sodass die zugrundeliegende Pathogenese komplexer ausfällt, als bisher gedacht. Die Patienten, die eine LOH auf diesem Chromosom aufwiesen, zeigten ein deutlich gesteigertes Risikoprofil. Weiter verdeutlichte es sich, dass der Genlokus des ARID1A häufig bei Meningeomen durch eine LOH auf dem Chromosom 1p betroffen ist. Dieses Phänomen zeigte sich zusätzlich im Western Blot sowie in der Immunhistochemie, in denen ebenfalls Alterationen, wie ein Verlust der spezifischen Bande oder eine reduzierte histologische Expression des Proteins, nachweisbar waren. Zusammenfassend stellt diese Studie damit ARID1A als ein mögliches Kandidatenprotein in der Kanzerogenese von Meningeomen heraus und eröffnet folgend die Möglichkeit, dies in weiteren Studien, beispielsweise durch Knock-out-Zellkulturen, zu prüfen. Durch die modifizierte und optimierte Methodik dieser Studie zur Prüfung einer LOH auf dem Chromosom 1p wurde eine neue Möglichkeit zur standardisierten Diagnostik an Meningeomen etabliert. Die Erkenntnisse dieser Studie können die Grundlage für weitere Studien stellen und damit den Weg für eine molekulargenetische Analyse als Standarddiagnostik bei Meningeomen eröffnen.

Analysis of the loss of the heterozygosity of chromosome 1p as well as of the subunits BAF47, BAF45c und BAF250a of the ATP-dependent chromatin remodeling complex SWI/SNF in meningiomas When the World Health Organization published the „WHO classification of tumours of the central nervous system” in 2016, the 1p/19q-status for oligodendrogliomas and the IDH-mutation for oligodendrogliomas and glioblastomas became an integral part of the classification system of these tumors. Similar molecular genetic diagnostics for meningiomas are not involved in these guidelines, with the result that these tumors remain to be classified by their morphology. However, these tumors, originating from the arachnoids, show an increase of molecular genetic alterations with increasing malignity. Recent evidence suggests that about 60% of meningiomas exhibit chromosomal aberrations like (partial)-gain or loss. The latter is also called “Loss of Heterozygosity” (LOH), defining the absence of the physiologic heterozygosity of two alleles. Depending on the WHO-grade, this phenomenon most frequently occurs on chromosomes 22q, 1p and 14q. If an LOH is present on one of the chromosomes mentioned, the tumor often has an increased malignancy and a higher risk of recurrence, which points out the diagnostic importance of these molecular genetic aberrations. Furthermore, an LOH on the chromosomal section 1p correlates with the clinical prognosis. Despite of the fact that the affected chromosomal regions have been identified clearly, a candidate gene has been found only for chromosome 22q: NF2 is an initiator of cancerogenesis as well as the cause of “neurofibromatosis type 2”. This paper therefore investigates three possible candidate genes with their respective gene locus found on the sections described. Especially the chromosomal section 1p has been examined in more detail. The examined proteins BAF47, BAF45c and BAF250a are subunits of the chromatin remodeling complex SWI/SNF. Its’ involvement in many other human neoplastic conditions has already been demonstrated, with BAF250a, also called ARID1A, being described as the most frequently mutated. This indicates a need to understand the initiating candidate genes on the affected chromosomes and further states the necessity for standardized molecular genetic diagnostics concerning the classification of meningiomas. The purpose of this study was not only to explore the relationship between chromosomal aberrations and the expression of different proteins, but also to examine how far the clinical behavior is affected by these changes in the genetics. This dissertation follows an experimental design, with in-depth analysis of the DNA and the protein expression of the described components of the SWI/SNF-complex. A total of 51 meningiomas were analyzed in a PCR-based microsatellite analysis regarding LOH status, and moreover in Western blot as well as immunohistochemistry in order to determine the expression of specific proteins. Utilizing six different microsatellite markers, it was possible to analyze a large region of chromosome 1p. Interestingly, in case of an LOH mostly the complete chromosome is affected, which leads to the assumption that the underlying pathogenesis is more complex than expected. Patients with LOH showed an increased risk profile. Furthermore, this study has clarified that the gene ARID1A is frequently affected by chromosomal losses in meningiomas. Additionally, this finding is confirmed by the findings of Western blot and immunohistochemistry, where changes were identified in the protein expression of ARID1A, most significantly a loss of the specific bands and reduced histological expression. In summary, this study highlights ARID1A as a possible candidate gene and protein in the carcinogenesis of meningiomas and subsequently opens up the possibility for future studies, for example in knock-out cell cultures. Our modified and optimized method to determine an LOH on chromosome 1p could be used for standardized diagnostics and classification of meningiomas. The findings of this study may serve as the basis for further studies concerning the groundwork for a standard molecular genetic examination of meningiomas.