Impact of genetic polymorphisms on the degree of ovarian response to gonadotrophin stimulation in patients undergoing ICSI treatment

Abstract

Abstract: Infertility is a common health problem associated with various medical, emotional, and social implications. It affects one in four couples in developing countries and one in six couples worldwide at least once during their reproductive lifetime. Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is the most common technique of assisted reproduction, accounting for approximately three-quarters of all infertility treatments worldwide. Despite the availability of new ovarian reserve markers and improvements in the methodologies that support personalization of In vitro fertilization (IVF) treatment protocols, an accurate definition of the modalities for applying personalized therapy to optimize efficacy and daily clinical management is still required. Genetic differences between patients are most likely the main factor responsible for different responses to the drugs. The gonadotrophin hormones, follicle-stimulating hormone (FSH) and luteinising hormone (LH), control folliculogenesis, and naturally occurring polymorphisms in genes encoding these hormones and their receptors may affect the ovarian response. However, a definite association between genetic polymorphisms and ovarian responses to gonadotrophins still needs to be determined. The purpose of this study was to detect the association between five single nucleotide polymorphisms of the following four genes follicle-stimulating hormone receptor (FSHR), anti-Mullerian hormone (AMH), luteinizing hormone/choriogonadotropin receptor (LHCGR), estrogen receptor (ESR1), and the degree of the ovarian response to gonadotrophin in Egyptian Patients undergoing IVF/ICSI therapy. The study population was Egyptian Women undergoing ICSI treatment. Two hundred and eighty women have participated in the study with mean aged 20 -35 years old. The clinical part of the study was performed in the IVF unit Sohag, Egypt starting with patient recruitment and selection. Preparatory phase and investigations before ICSI then Controlled ovarian stimulation (COS) by Long Gonadotrophin releasing hormone (GnRH) agonist protocol, patient follow-up, and samples collection. The patients were classified according to ovarian response into three groups: normal responders (retrieved oocytes=4-15) (n= 80), poor responders (retrieved oocyte <4) (n= 92), and high responders (retrieved oocytes= > 15) (n= 108). Approximately 5.0 ml of blood samples were collected from all participants in EDTA tubes and stored at -80°C until the genetic analysis to be performed in assisted reproductionand Genetics Unit, Saarland University, Germany. Genomic DNA was extracted from the blood samples, and the PCR and DNA sequencing were performed to compare the variation in the DNA sequencing between the different study groups. The quantitative PCR (qPCR) was performed to evaluate the expression level of the following genes: FSHR, AMH, LHCGR, ESR1, and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) as a reference gene among the study groups. Data analysis was performed by SPSS software. The Kruskal–Wallis (H-test) and Mann-Whitney (U-test) were applied to compare the median quantitative variables between the study groups. The Spearman rank correlation was used to evaluate the association between genetic polymorphisms (rs4073366, rs6166, rs6165, rs2234693; rs17854573) and the different investigated parameters including clinical parameters e.g., age, Body mass index (BMI), hormonal parameters e.g., AMH level, FSH Level and ICSI cycle parameters e.g., dose of gonadotrophin, number of collected oocytes, number of fertilised oocytes and number of transferred embryos. Regarding the qPCR data, the comparative analysis was used to calculate the expression level of tested genes in the cases “poor/high responder” versus controls “normal responder”. The results were considered statistically significant when P-value ≤ 0.05. The data analysis of DNA sequencing showed a significant difference in the frequency of the following genotypes FSHR (rs6166), AMH (rs17854573), and ESR1 (rs2234693) in the poor responders compared to normal responders (P ≤ 0.001, P = 0.010, and P ≤ 0.001) respectively. No significant difference has been found in the frequency of LHCGR (rs4073366) and FSHR (rs6165) genotypes in patients with poor ovarian response compared to others with a normal ovarian response (P = 0.312 and P = 0.192). Besides, no significant difference has been found in the frequency of the FSHR (rs6166), FSHR (rs6165), ESR1 (rs2234693), AMH (rs17854573) or LHCGR (rs4073366) genotypes in high responders compared to normal responders (P = 0.074, P = 0.353, P = 0.060, P = 0.060 and P = 0.091 respectively). Moreover, a significant difference has been found between the poor responders and the normal responders in the total dose of gonadotropin, the number of stimulation days, the number of collected oocytes, the number of injected oocytes, the number of fertilized oocytes, and the number of embryo transfer.On the other hand, the analysis of qPCR results revealed a variation between the study groups (poor, normal, and high response) in the expression levels of FSHR (rs6166), FSHR (rs6165), AMH, LHCGR, and ESR1 gene (P ≤ 0.0001). In conclusion, The results of this study suggest that polymorphisms in the genes for key reproductive hormones (AMH, FSHR, and ESR1) in combination with the patient’s clinical characteristics and hormonal biomarkers could be used to predict the ovarian response to gonadotrophins, to personalize and adjust the dose of gonadotrophins before starting the stimulation protocol, to improve efficacy and to avoid possible complications such as cycle cancellation and OHSS; and, finally, to improve the pregnancy rate in patients undergoing ICSI treatment.

Zusammenfassung: Infertilität ist ein häufiges Gesundheitsproblem, das mit verschiedenen medizinischen, emotionalen und sozialen Auswirkungen einhergeht. Es betrifft eines von vier Paaren in Entwicklungsländern und eines von sechs Paaren weltweit mindestens einmal im Laufe ihres reproduktiven Lebens. Die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) ist die häufigste Technik der assistierten Reproduktion und macht weltweit etwa drei Viertel aller Unfruchtbarkeitsbehandlungen aus. Obwohl neue Marker für die ovarielle Reserve zur Verfügung stehen und die Methoden zur Personalisierung der Behandlungsprotokolle für die In-vitro-Fertilisation (IVF) verbessert wurden, ist eine genaue Definition der Modalitäten für die Anwendung der personalisierten Therapie zur Optimierung der Wirksamkeit und des täglichen klinischen Managements nach wie vor erforderlich. Genetische Unterschiede zwischen den Patienten sind höchstwahrscheinlich der Hauptfaktor, der für die unterschiedlichen Reaktionen auf die Medikamente verantwortlich ist. Die Gonadotropin Hormone FSH und luteinisierendes Hormon (LH) steuern die Follikulogenese, und natürlich vorkommende Polymorphismen in Genen, die für diese Hormone und ihre Rezeptoren kodieren, können die Reaktion der Eierstöcke beeinflussen. Ein eindeutiger Zusammenhang zwischen genetischen Polymorphismen und der Reaktion der Eierstöcke auf Gonadotropine muss jedoch erst noch festgestellt werden. Ziel dieser Studie war es, den Zusammenhang zwischen fünf Einzelnukleotid-Polymorphismen der folgenden vier Gene Follikel-stimulierendes Hormon-Rezeptor (FSHR), Anti-Mullerian-Hormon (AMH), Luteinisierendes Hormon/Choriogonadotropin-Rezeptor (LHCGR), Östrogenrezeptor (ESR1) und dem Grad der ovariellen Reaktion auf Gonadotropin bei ägyptischen Patientinnen, die sich einer IVF/ICSI-Therapie unterziehen, zu ermitteln. Die Studienpopulation bestand aus ägyptischen Frauen, die sich einer ICSI-Behandlung unterzogen. Zweihundertachtzig Frauen, mit einem Mittelalter von 20 bis 35 Jahren, nahmen an dieser Studie teil. Der klinische Teil der Studie wurde in der IVF-Abteilung in Sohag, Ägypten durchgeführt. Zuerst erfolgten die Rekrutierung und Auswahl der Patientinnen, dann die Vorbereitungsphase und Untersuchungen vor ICSI danach die kontrollierte ovarielle Stimulation (COS) durch langwirkende GnRH-Agonisten-Protokoll.Anschließend erfolgte das Follow-up. Nach der ovariellen Reaktion wurden die Patientinnen in drei Gruppen eingeteilt: normale Responder (entnommene Eizellen = 4-15) (n = 80), schlechte Responder (entnommene Eizellen < 4) (n = 92) und hohe Responder (entnommene Eizellen =>) 15) (n = 108). Ca. 5,0 ml Blutproben wurden von allen Teilnehmerinnen in EDTA-Röhrchen gesammelt und bei -80° C, bis die genetische Analyse in der Abteilung von der assistierten Reproduktion und Genetik an der Universität des Saarlandes in Deutschland, gelagert. Genomische DNA wurde aus den Blutproben extrahiert und die PCR und die DNA-Sequenzierung wurden durchgeführt, um die Variation in der DNA- Sequenzierung zwischen den verschiedenen Studiengruppen zu vergleichen. Die quantitative PCR (qPCR) wurde durchgeführt, um das Expressionsniveau der folgenden Gene zu bewerten: FSHR, AMH, LHCGR, ESR1 und Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) als Referenzgen in den Studiengruppen. Die Datenanalyse wurde mit der Software SPSS durchgeführt. Der Kruskal-Wallis-Test (H-Test) und der Mann-Whitney-Test (U-Test) wurden angewandt, um den Median der quantitativen Variablen zwischen den Studiengruppen zu vergleichen. Die Spearman-Rangkorrelation wurde verwendet, um den Zusammenhang zwischen dem genetischen Polymorphismus (rs4073366, rs6166, rs6165, rs2234693; rs17854573) und den verschiedenen untersuchten Parametern zu bewerten einschließlich klinischer Parameter wie Alter, Body-Mass-Index (BMI), hormoneller Parameter wie AMH-Spiegel, FSH-Spiegel und ICSI-Zyklusparameter wie Gonadotropin-Dosis, Anzahl der entnommenen Eizellen, Anzahl der befruchteten Eizellen und Anzahl der übertragenen Embryonen. In Bezug auf die qPCR-Daten wurde die vergleichende Analyse verwendet, um das Expressionsniveau der getesteten Gene in den Fällen "schlechte/hohe Responder" gegenüber den Kontrollen "normale Responder" zu berechnen. Die Ergebnisse wurden als statistisch signifikant angesehen, wenn der P-Wert ≤ 0,05 war. Die Datenanalyse der DNA-Sequenzierung zeigte einen signifikanten Unterschied bezüglich der Häufigkeit der folgenden Genotypen FSHR (rs6166), AMH (rs17854573) und ESR1 (rs2234693) bei den schlechten Respondern im Vergleich zu den normalen Respondern (P ≤ 0,001, P = 0,010 und P. ≤ 0,001). Es wurde kein signifikanter Unterschied in der Häufigkeit der Genotypen von LHCGR (rs4073366) und FSHR (rs6165) bei den schlecht ansprechenden Respondern im Vergleich zu den normalen Respondern beobachtet (P ≤ 0,312 und P = 0,192).Außerdem wurde kein signifikanter Unterschied in der Häufigkeit der Genotypen FSHR (rs6166), FSHR (rs6165), ESR1 (rs2234693) , AMH (rs17854573) oder LHCGR (rs4073366) bei den High-Respondern im Vergleich zu den normalen Respondern (P ≤ 0,074) gefunden , P ≤ 0,35 3, P ≤ 0,060, P ≤ 0,060 bzw. P ≤ 0,091 ). Darüber hinaus wurde ein signifikanter Unterschied zwischen den schlechten Respondern und den normalen Respondern bezüglich der Gesamtdosis von Gonadotropin, der Anzahl der Stimulationstage, der Anzahl der gesammelten Eizellen, der Anzahl der injizierten Eizellen, der Anzahl der befruchteten Eizellen und der Anzahl der gefunden Embryotransfer sowie die Anzahl der kryokonservierten Embryonen. Andererseits zeigte die Analyse der qPCR-Ergebnisse einen Unterschied zwischen den Studiengruppen (schlechtes, normales und hohes Ansprechen) in den Expressionsniveaus der Gene FSHR (rs6166), FSHR (rs6165), AMH, LHCGR und ESR1 (P ≤ 0,0001). Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Studie, dass Polymorphismen in den Genen für die wichtige Fortpflanzungshormone (AMH, FSHR und ESR1) in Kombination mit den klinischen Merkmalen der Patientin und hormonellen Biomarkern verwendet werden könnten, um die ovarielle Reaktion auf Gonadotropen vorherzusagen, zu personalisieren und die Dosis von Gonadotropen vor Beginn des Stimulationsprotokolls anzupassen, um die Wirksamkeit zu verbessern und mögliche Komplikationen wie Zyklusabbruch und OHSS zu vermeiden; und schließlich zur Verbesserung der Schwangerschaftsrate bei Patientinnen, die sich einer ICSI-Behandlung unterziehen.