Identification and Characterization of the putative phosphatase PALD1 as a previously unknown component of the Sonic Hedgehog Signaling Pathway

Abstract

During the past decades primary cilia were brought into the focus of research. Despite the greatly increased interest in primary cilia, many questions remain unanswered. The small reaction space of primary cilia is associated with low amounts of protein which poses enormous challenges for research. Furthermore, primary cilia cannot be isolated like completely membrane-enclosed organelles because they do possess a highly specialized membrane but which is continuous with the plasma membrane. Based on the first methodological approach to study the ciliary proteome easily and reliably using proximity labeling and mass-spectrometric analysis, a new technique to study the ciliary proteome was established within this work using Cilia-APEX2. The Cilia-APEX2 construct consists of an improved cilia-localized ascorbate peroxidase, APEX2, which allows higher labeling efficiency at lower transgene expression than the previously used Cilia-APEX as demonstrated within this work. Thus, Cilia-APEX2 enabled to study time resolved remodeling of the cilia proteome during Sonic Hedgehog signaling for the first time (May et al., 2021). The Sonic Hedgehog signaling pathway is a fundamental signaling pathway of the embryonic development and depends in mammals strictly on primary cilia. Disruption of the Sonic Hedgehog signaling pathway leads to death at an early embryonic stage or to severe birth defects. Nevertheless, many of the underlying mechanisms remain poorly understood. Using Cilia-APEX2, new information on the mechanisms of Sonic Hedgehog signaling in Inner Medullary Collecting Duct 3 (IMCD3) cells were obtained e.g. the putative phosphatase Paladin (PALD1) was associated with Sonic Hedgehog signaling for the first time. Within this work, it was shown that PALD1 localizes to primary cilia after activation of Sonic Hedgehog Signaling via the Sonic Hedgehog receptor Protein patched homolog 1 (PTCH1). It was further shown, that when PTCH1 is bypassed in Sonic Hedgehog Signaling activation via use of the Smoothened Agonist (SAG), PALD1 still localizes to primary cilia. PALD1 does not complexate with the Sonic Hedgehog effector Smoothened (SMO) permanently but co-localized with SMO to primary cilia of IMCD3 cells after activation of Sonic Hedgehog signaling. Screening of different cell lines for PALD1 expression as well as a comparative phylogenetic analysis, revealed that PALD1 is conserved among species and present in different human and murine cell lines. To investigate the role of PALD1 further, different cell lines which lacked PALD1 were generated and analyzed such as IMCD3 cells, murine Fibroblasts and murine Myoblasts (May et al., 2021). Furhtermore, it was shown that the here generated IMCD3 Pald1-/- cells are situated in a pre-activated Sonic Hedgehog signaling state. This was demonstrated by changes in two Sonic Hedgehog components, the G protein-coupled receptor GPR161 and the glioma-associated zinc finger 3 (GLI3) transcription factor, among others. Nevertheless, IMCD3 Pald1-/- cells can be further activated by addition of Sonic Hedgehog inducing reagents. Ciliary accumulation of PALD1 was shown to be dependent on both cAMP and the protein complex of intraflagellar transport proteins 27 and 25. Summary 11 Furthermore, the accumulation of PALD1 is possibly influenced by the protein kinase A. Ciliary accumulation of PALD1 in dependence of active Sonic Hedgehog Signaling was also observed in Myoblasts within this work and it was shown that differentiation of Myoblasts into muscle cells was impaired after loss of PALD1. In Fibroblasts, even though no ciliary accumulation of PALD1 was detected, Sonic Hedgehog signaling pre-activation was also observed in a transcriptional analysis indicating specific but similar tissue specific functions for PALD1 among different cell lines. While the role of PALD1 in Fibroblasts and Myoblasts needs further research, it was demonstrated, that PALD1 controls Sonic Hedgehog dependent processes in different cell lines. The identification of PALD1 as a previously unknown Sonic Hedgehog signaling component highlights the improved methodology of the Cilia APEX2 approach. Moreover, PALD1 was identified in this work as a novel negative mediator of the Sonic Hedgehog signaling pathway, and the underlying molecular mechanisms were studied in detail. The identification of such fine-regulatory components of the pathway has been tended to be neglected in the past and opens new opportunities for therapeutic regulation by fine-tuning the highly sensitive and tightly regulated Sonic Hedgehog pathway.

In den letzten Jahrzehnten sind primäre Zilien in den Fokus der Forschung gerückt. Trotz des stark gestiegenen Interesses bleiben jedoch viele Fragen unbeantwortet. Der kleine Reaktionsraum des primären Ziliums ist mit sehr geringen Proteinmengen verbunden, was eine große Herausforderung bei der Untersuchung darstellt. Des Weiteren können primäre Zilien nicht wie vollständig membranumschlossene Organellen durch übliche Methoden isoliert werden, da sie zwar eine hochspezialisierte Membran besitzen, diese jedoch kontinuierlich mit der Plasmamembran verbunden ist. Basierend auf dem ersten methodischen Ansatz zur einfachen und zuverlässigen Untersuchung des Zilienproteoms mittels Proximity Labeling und massenspektrometrischer Analyse, wurde in dieser Arbeit eine neue Technik zur Untersuchung des Zilienproteoms unter Verwendung von Cilia-APEX2 etabliert. Das Cilia-APEX2-Konstrukt besteht aus einer verbesserten, in den Zilien lokalisierten Ascorbatperoxidase, APEX2, die eine höhere Markierungseffizienz bei geringerer Transgenexpression als das zuvor verwendete Cilia-APEX Konstrukt ermöglicht, wie in dieser Arbeit gezeigt wurde. Somit konnte durch Cilia-APEX2 zum ersten Mal der zeitlich aufgelöste Umbau des Zilienproteoms während der Sonic Hedgehog-Signalisierung untersucht werden (May et al., 2021). Der Sonic-Hedgehog-Signalweg ist ein grundlegender Signalweg der Embryonalentwicklung und hängt bei Säugetieren von primären Zilien ab. Eine Unterbrechung des Sonic-Hedgehog-Signalwegs führt zum Tod in einem frühen Embryonalstadium oder zu schweren Geburtsfehlern. Mit Hilfe von Cilia- APEX2 wurden neue Informationen über die Mechanismen der Sonic Hedgehog-Signalübertragung in Zellen des Inner Medullary Collecting Duct 3 (IMCD3) gewonnen, z. B. wurde die mutmaßliche Phosphatase Paladin 1 (PALD1) erstmals mit der Sonic Hedgehog-Signalübertragung in Verbindung gebracht. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass PALD1 nach der Aktivierung des Sonic-Hedgehog-Signalweges über das Rezeptor Patched Homolog 1 (PTCH1) in primäre Zilien lokalisiert. Bei einer Umgehung von PTCH1 über die Aktivierung des Signalweges durch den Smoothened Agonist (SAG) lokalisiert PALD1 ebenfalls in primäre Zilien. PALD1 komplexiert nicht permanent mit dem Sonic-Hedgehog-Effektor Smoothened (SMO), wird aber nach Aktivierung des Sonic-Hedgehog-Signalwegs zusammen mit SMO in primären Zilien von IMCD3-Zellen co-lokalisiert. Ein Screening verschiedener Zelllinien auf PALD1–Expression sowie eine vergleichende phylogenetische Analyse ergaben, dass PALD1 zwischen den Spezies konserviert und in verschiedenen menschlichen und murinen Zelllinien vorhanden ist. Um die Rolle von PALD1 weiter zu untersuchen, wurden Zelllinien generiert und analysiert, die kein PALD1 exprimierten. Dabei handelte es sich unter anderem um IMCD3-Zellen, aber auch um murine Fibroblasten und murine Myoblasten (May et al., 2021). Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass sich die hier erzeugten IMCD3 Pald1-/- Zellen in einem voraktivierten Sonic Hedgehog-Signalzustand befinden. Dies konnte unter anderem durch Zusammenfassung 13 Veränderungen zweier Sonic Hedgehog Komponenten, dem G-Protein gekoppelten Rezeptor GPR161 und dem Gliom assoziierten Zink Finger 3 (GLI3) Transkriptionsfaktor gezeigt werden. Dennoch können IMCD3 Pald1-/- Zellen durch Zugabe von Sonic Hedgehog induzierenden Reagenzien weiter aktiviert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die ziliäre Akkumulation von PALD1 sowohl von cAMP als auch von dem Proteinkomplex der Intraflagellaren Transport Proteine 27 und 25 abhängig ist. Weiterhin wird die Akkumulation von PALD1 möglicherweise durch die Protein Kinase A beeinflusst. Die ziliäre Akkumulation von PALD1 in Abhängigkeit von aktivem Sonic Hedgehog-Signal wurde in dieser Arbeit auch in Myoblasten beobachtet und es wurde gezeigt, dass die Differenzierung von Myoblasten in Muskelzellen nach Verlust von PALD1 beeinträchtigt war. In Fibroblasten wurde keine ziliäre Akkumulation von PALD1 festgestellt, und es wurden keine Defekte bei der Zellmigration nach dem Verlust von PALD1 beobachtet. In einer transkriptionellen Analyse von Fibroblasten wurde jedoch eine Voraktivierung der Sonic-Hedgehog-Signalübertragung beobachtet, was auf spezifische, aber ähnliche Funktionen von PALD1 in verschiedenen Zelltypen hindeutet. Während die Rolle von PALD1 in Fibroblasten und Myoblasten noch weiter erforscht werden muss, konnte somit gezeigt werden, dass PALD1 Sonic-Hedgehog-abhängige Prozesse in verschiedenen Zelllinien kontrolliert. Die Identifizierung von PALD1 als bisher unbekannte Sonic Hedgehog-Signalkomponente unterstreicht die verbesserte Methodik des Cilia-APEX2-Ansatzes. Darüber hinaus wurde PALD1 in dieser Arbeit als ein neuer, bisher unbekannter, negativer Mediator des Sonic Hedgehog-Signalwegs identifiziert und die molekularen Mechanismen wurden eingehend untersucht. Die Identifizierung solcher feinregulierenden Komponenten des Signalwegs wurde in der Vergangenheit eher vernachlässigt und eröffnet neue Möglichkeiten zur therapeutischen Regulierung über die Feinabstimmung des hochsensiblen und streng regulierten Sonic Hedgehog-Signalwegs.