Über die physiologische Funktion von TRPV6-Ionenkanälen in Plazenta, Eihülle und Uterus

Abstract

TRPV6-Ionenkanäle besitzen eine besonders hohe Selektivität für Ca2+-Ionen und sind an der Ca2+-Homöostase verschiedener Gewebe wie z.B. Uterus, Plazenta und Nebenhoden beteiligt. Demgemäß beeinflusst ihr Fehlen die Reproduktionsmechanismen beider Geschlechter. So zeigen homozygote TRPV6-defiziente, männliche Mäuse eine gestörte Spermienreifung, welche auf eine erhöhte Ca2+-Konzentration im Lumen des Nebenhodens zurückzuführen ist. Dagegen zeigen TRPV6-defiziente Embryonen, die sich in TRPV6-defizienten Müttern entwickeln, ein verzögertes Wachstum und eine unzureichende Knochenmineralisierung. Dieser Phänotyp der Maus ähnelt dem Krankheitsbild eines neonatalen Hyperparathyroidismus beim Menschen, dem eine unzureichende Calciumversorgung des Embryos über die Plazenta aufgrund von Trpv6-Genmutationen zugrunde liegt. Die Neugeborenen leiden an Skelettverformungen und untermineralisierten Knochen. Zur Untersuchung der Ursachen embryonaler Fehlbildungen in TRPV6-defizienten Mäusen wurden in dieser Arbeit TRPV6-exprimierende Gewebe analysiert, welche an der Embryogenese beteiligt sind. Im nicht schwangeren Uterus, im schwangeren Uterus, in Plazenta und in Trophoblasten sowie in der Eihülle konnte das TRPV6-Protein nach Immunpräzipitation durch Massenspektrometrie und Western Blot-Analyse nachgewiesen werden. TRPV6-defiziente Gewebe zeigten eine verstärkte Expression verschiedener Proteasen. In der Plazenta war Granzyme F, in den Trophoblasten waren die Granzyme C, F, G und HTRA1, im schwangeren Uterus die Granzyme C, E, F und in der Eihülle war Cathepsin D signifikant erhöht. Die Proteaseinhibitoren Alpha-1-antitrypsin 1-4 (A1AT4) und Alpha-1-antitrypsin 1-5 (A1AT5) waren hingegen in Abwesenheit von TRPV6 deutlich reduziert. In TRPV6-defizienten Plazenten zeigte sich die Oberfläche der Labyrinthzone verringert und die Chorionplatte vergrößert. Die reduzierte Oberfläche der Labyrinthzone führt wahrscheinlich zu einem reduzierten Stofftransport und könnte eine mögliche Ursache für die Unterversorgung von Embryonen in TRPV6-defizienten Tieren sein. Trophoblasten aus der Labyrinthzone von TRPV6-defizienten Plazenten vernetzten sich in Zellkultur schlechter und ihre basale Ca2+-Konzentration war signifikant reduziert. Ihr Migrationsverhalten und ihre Vitalität waren unverändert. Konform zu der Erhöhung von Serinproteasen zeigte sich eine deutliche Reduktion des extrazellulären Matrixproteins (ECM) Fibronektin. Entsprechend zeigten Proteinlysate aus TRPV6-defizienten Plazenten verstärkten proteolytischen Abbau von Fibronektin. Diese Daten belegen die Hypothese, dass TRPV6-Proteine die Struktur der extrazellulären Matrix im plazentaren Labyrinth kontrollieren. Die Eihülle von TRPV6-defizienten Tieren war ebenso wie die Embryonen kleiner. Ihre Dicke war jedoch unverändert. Ähnlich wie in den Trophoblasten und der Plazenta war eine Protease, Cathepsin D, verstärkt exprimiert, die Proteaseinhibitoren A1AT4 und A1AT5 waren reduziert und Fibronektin degradiert. Dies legt nahe, dass TRPV6 auch in diesem Gewebe eine wesentliche Rolle bei der Kontrolle der extrazellulären Matrix spielt. Daher wurde der transepitheliale Widerstand von Eihüllen in Gegenwart und Abwesenheit von TRPV6 bestimmt. Er zeigte sich (trotz reduziertem Fibronektin) bei TRPV6-defizienten Eihüllen ebenso erhöht, wie in Anwesenheit eines TRPV6-Antagonisten in Eihüllen von WT Mäusen. Offensichtlich beeinflussen TRPV6-Ionenkanäle auch die Permeabilität der Eihülle während der Embryogenese. Der schwangere und der nicht schwangere Uterus zeigten keine offensichtlichen morphologischen Veränderungen zwischen WT- und TRPV6-defizienten Tieren. Im TRPV6-defizienten schwangeren Uterus war die Expression der Granzyme C, D, E, F und G erhöht, der Proteaseinhibitor A1AT5 reduziert, die Menge an Fibronektin jedoch unverändert. Im nicht-schwangeren Uterus waren keine Granzyme nachweisbar, jedoch war die Menge des Proteaseinhibitors A1AT4 in TRPV6-defizienten Uteri während des Diestrus und Metestrus signifikant reduziert, Fibronektin dagegen war nicht verändert. Der nicht-schwangere Uterus zeigte ein zyklusabhängiges Expressionsmuster von TRPV6 mit der größten Menge TRPV6 während des Estrus. Die zyklusabhängige Expression von TRPV6 und dessen Lokalisation im Uterusepithel legt die Vermutung nahe, dass TRPV6 an initialen Prozessen der Schwangerschaft wie z.B. der Adhäsion und Invasion der Blastozyste oder der Dezidualisierung beteiligt sein könnte.

TRPV6 ion channels have a particularly high selectivity for Ca2+ ions and are involved in the Ca2+ homeostasis of various tissues such as the uterus, placenta and epididymis. Accordingly, their absence affects the reproductive mechanisms of both sexes. Homozygous TRPV6-deficient male mice show impaired sperm maturation, caused by an enhanced Ca2+ concentration in the lumen of the epididymis. In contrast, TRPV6-deficient embryos from TRPV6-deficient mothers show delayed growth and insufficient bone mineralization. This phenotype in the mouse resembles the clinical picture of neonatal hyperparathyroidism in humans, which is based on an inadequate calcium supply of the embryo via the placenta due to Trpv6 gene mutations. The newborns suffer from skeletal dysplasia and under-mineralized bones. To investigate the causes of embryonic malformations in TRPV6-deficient mice, TRPV6-expressing tissues, which are involved in embryogenesis, were analyzed in this thesis. In the non-pregnant uterus, the pregnant uterus, the placenta and trophoblasts, as well as the yolk sac, the TRPV6 protein was detected after immunoprecipitation by mass spectrometry and Western blot analysis. Tissues with a lack of TRPV6 showed an increase of various proteases. Granzyme F was significantly higher in the placenta, granzymes C, F, G and HTRA1 in the trophoblasts, granzymes C, E, F in the pregnant uterus and cathepsin D in the yolk sac. In contrast, the protease inhibitors alpha-1-antitrypsin 1-4 (A1AT4) and alpha-1-antitrypsin 1-5 (A1AT5) were significantly reduced in the absence of TRPV6. In TRPV6-deficient placentas, the surface of the labyrinth zone was reduced and the chorionic plate was enlarged. The decreased surface area of the labyrinth zone probably leads to reduced nutrient and mineral transport and could be a possible cause for the undersupply of embryos in TRPV6-deficient animals. Trophoblasts from the labyrinth zone of TRPV6-deficient placentas networked less well in cell culture and their basal Ca2+ concentration was significantly reduced. Their migratory behavior and vitality were unaffected. In line with the increase in serine proteases, there was a clear reduction in the extracellular matrix protein (ECM) fibronectin. Accordingly, protein lysates from TRPV6-deficient placentas showed increased proteolytic degradation of fibronectin. This data supports the hypothesis that TRPV6 proteins control the structure of the extracellular matrix in the placental labyrinth zone. The yolk sac of TRPV6-deficient animals was just as smaller as the embryos. However, their thickness was unchanged. As in the trophoblasts and the placenta, a protease, cathepsin D, was expressed to an increased extent. The protease inhibitors A1AT4 and A1AT5 were reduced, and fibronectin was degraded. This suggests that TRPV6 also plays an essential role in controlling the extracellular matrix in this tissue. Therefore, the transepithelial resistance of yolk sac in the presence and absence of TRPV6 was determined. It was found to be increased (despite reduced fibronectin) in TRPV6-deficient yolk sac as well as in the presence of a TRPV6 antagonist in the yolk sac of WT mice. Apparently, TRPV6 ion channels also influence the permeability of the yolk sac during embryogenesis. The pregnant and non-pregnant uterus showed no apparent morphological changes between WT- and TRPV6-deficient animals. In the TRPV6-deficient pregnant uterus, the amount of granzymes C, D, E, F and G was increased, the protease inhibitor A1AT5 was reduced, but the amount of fibronectin was unchanged. Granzymes were not detectable in the non-pregnant uterus. However, the amount of the protease inhibitor A1AT4 in TRPV6-deficient uteri was significantly reduced during the diestrus and metestrus, whereas fibronectin was not changed. The non-pregnant uterus showed a cycle-dependent expression pattern of TRPV6 with the largest amount of TRPV6 during estrus. The cycle-dependent expression of TRPV6 and its localization in the uterine epithelium suggest that TRPV6 may be involved in the initial processes of pregnancy such as adhesion and invasion of the blastocyst or decidualization.