Die Bedeutung der TRPC1/C4/C5-Kanäle für die synaptische Transmission in hippokampalen Neuronen

Abstract

Canonical Transient Receptor Potential channels (TRPC-Kanäle) bilden nicht-selektive Ca2+- permeable Kanäle. Sie sind im Gehirn weit verbreitet, aber ihre Funktion ist bisher noch weitgehend unverstanden. In dieser Arbeit werden Kulturen hippokampaler Neurone aus dem Gehirn von Wildtyp- und TRPC1/C4/C5-triple-defizitären Mäusen dazu verwendet, die Bedeutung dieser Kanäle in der synaptischen Transmission zu untersuchen. Anhand von elektrophysiologischen Messungen in autaptischen Kulturen wird gezeigt, dass der Verlust der TRPC1/TRPC4/TRPC5-Kanäle die basale evozierte Neurotransmisson, die Poolgröße fusionsbereiter Vesikel und die Wiederauffüllrate dieses Pools erniedrigt. Dagegen wird die Synaptogenese und die quantale Transmitterfreisetzung durch die TRPC-Kanal-Defizienz nicht verändert. Durch Expression von TRPC1 in Wt-Neuronen wird die klassische synaptische Depression während hochfrequenter Stimulation in eine Kurzzeitfazilitierung umgekehrt. Dieser Effekt kann durch Abpuffern des, während hochfrequenter Stimulation präsynaptisch ansteigenden, Kalziums verhindert werden. Gemeinsam mit dem immunzytochemischen Nachweis von TRPC1 in der Präsynapse legen die Daten nahe, dass TRPC-Kanäle einen zusätzlichen Ca2+-Einstrom an der Präsynapse vermitteln und dadurch die synaptische Stärke in Neuronen modulieren. Durch Überexpression von TRPC1 oder TRPC5 in WT- und TRPC1/C4/C5-defizienten Zellen werden Unterschiede in der Oligomerisierung der Kanäle festgestellt. Während TRPC5 funktionelle homotetramere Ionenkanäle bilden kann, ist TRPC1 auf die anderen TRPC-Varianten angewiesen, um als Ionenkanal zu fungieren. Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor attachment receptor (SNARE)- Proteine vermitteln die Fusion verschiedener Membranen. Die mechanistische Rolle der Transmembrandomäne (TMD) von SNARE-Proteinen und ob diese eine Funktion ausübt, die über die Verankerung in der Membran hinausgeht, ist bisher jedoch noch unbekannt. Hier wird gezeigt, dass die Ca2+-abhängige Exozytose in Neuronen durch Substitution der TMD von Synaptobrevin 2 mit der α-Helix-stabilisierenden Aminosäure Leucin verringert wird, wohingegen die Substitution der Synaptobrevin 2-TMD durch die β-verzweigte Aminosäure Valin die Funktion des Wildtyp-Proteins wiederherstellt. Diese Beobachtungen zeigen, dass β-verzweigte Aminosäuren die konformationelle Flexibilität der TMD erhöhen und dadurch zur erleichterten Fusion synaptischer Vesikel beitragen. Die Juxtamembranregion von Synaptobrevin 2 enthält zwei hochkonservierte membranständige Tryptophanreste. Substitution dieser amphiphilen Tryptophane durch hydrophobe Alaninreste reduziert die synaptische Transmission ohne die Kinetik der Fusionsereignisse zu verändern. Diese Beobachtungen weisen auf eine verminderte Anzahl fusions-kompetenter Vesikel hin, was sich vermutlich auf eine Veränderung des Insertionswinkels der Synaptobrevin 2- TMD zurückführen lässt.

Canonical transient receptor (TRPC)-channels form non-selective Ca2+- permeable channels. They are widely distributed in the brain but their function is mostly unknown so far. In this thesis, cultures of hippocampal neurons from the brains of wild type and TRPC1/C4/C5-triple-deficient mice are used to investigate the role of these channels in synaptic transmission. Electrophysiological measurements in autaptic cultures show that the loss of TRPC1/TRPC4/TRPC5 channels lowers the basal evoked neurotransmisson, the pool size of readily-releasable vesicles and the replenishment rate of this pool. In contrast, neither synaptogenesis nor properties of quantal transmitter release are altered by TRPC channel deficiency. By expressing TRPC1 in Wt neurons, classical synaptic depression is reversed into short-term facilitation during high frequency stimulation. This effect can be prevented by buffering the calcium that increases presynaptically during high frequency stimulation. Together with the colocalization of TRPC1 with the synaptic marker protein synapsin, the data suggest that TRPC channels mediate an additional Ca2+-influx at the presynapse, thereby modulating synaptic strength in neurons. Overexpression of TRPC1 or TRPC5 in Wt- and TRPC1/C4/C5-deficient cells unveiled differences regarding the oligomerisation of the channels. While TRPC5 can form functional homotetrameric ion channels, TRPC1 depends on the other TRPC variants to act as ion channels. Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor attachment receptor (SNARE) proteins mediate the fusion of different membranes. However, the mechanistic role of the transmembrane domain (TMD) of SNARE proteins and whether it fulfills a function that goes beyond anchoring in the membrane is still unknown. Here it is shown that Ca2+-dependent exocytosis in neurons is reduced by substitution of the TMD of synaptobrevin 2 with the α-helix-stabilizing amino acid leucine, whereas replacement of synaptobrevin 2-TMD by the β-branched amino acid valine restores the function of the wild-type protein. These observations show that β-branched amino acids increase the conformational flexibility of TMD and thereby contribute to the fusion of synaptic vesicles. The juxtamembrane region of Syb2 contains two highly conserved membrane-bound tryptophan residues. Substitution of these amphiphilic tryptophanes by hydrophobic alanine residues reduces synaptic transmission without altering the kinetics of fusion events. These observations are attributed to the reduced number of fusion-competent vesicles caused by an alteration of the insertion angle of the Syb2- TMD into the membrane.