Charakterisierung der Epithelzelllinie HCE-T (RCB 2280) im Vergleich zu primären Limbusepithelzellkulturen sowie primären Korneaepithelzellen

Abstract

Ziel: Die korneale HCE-T Zelllinie ist aktuell ein akzeptiertes Modell für pharmakologische Versuche über Barriereeigenschaften und Toxizität von Medikamenten. Es ist bisher wenig über die Differenzierung der HCE-T Zelllinie bekannt. Diese Zelllinie sollte die gleiche Differenzierung wie das korneale Ursprungsgewebe widerspiegeln. Daher wird die HCE-T Zelllinie in dieser Arbeit auf mRNA und Proteinebene charakterisiert. Diese Daten wurden mit differenzierten primären Korneaepithel-Zellen und Limbusepithelzellen verglichen. Ziel war es, ein besseres Verständnis der Korneaepithel-Zellen und deren Differenzierungsprozess zu gewinnen, um zu klären, ob an dieser Zelllinie weitergehende in vitro Versuche zu den Differenzierungsprozessen des Hornhautepithels durchgeführt werden können. Methoden: Die HCE-T Zelllinie ist kommerziell erwerblich bei dem RIKEN-Institut (RCB 2280). Die unterschiedlichen Passagen der Zelllinie wurden zum einen in einem Standardmedium mit fetalem Kälberserum (HCE-T) und zum anderen in einem serumfreien Medium kultiviert (HCE-T/KSFM). Die primären Korneaepithel-Zellen (pCEZ) und die limbalen Epithelzellen (LEZ) wurden durch eigene Präparation von Spenderhornhäuten der LIONS Hornhautbank Saar-Lor-Lux Trier/Westpfalz der Augenklinik des Universitätsklinikums Homburg/Saar, Deutschland, gewonnen und in serumfreiem Medium kultiviert. Mit der quantitativen Polymerasenkettenreaktion wurde die mRNA-Expression von den Keratin- und Zellverbindungsmarkern Keratin 3 (KRT3), Keratin 12 (KRT12), Desmoglein 1 (DSG1), Keratin 13 (KRT13) und Keratin 19 (KRT19), den Stammzell- und Differenzierungsmarkern Paired box Gen 6 (PAX6), Aldehydehydrogenase 1 Mitglied A1 (ALDH1A1), Alkoholdehydrogenase 7 (ADH7), Tumorprotein 63 (TP63) und ATP-binding castte subfamily G Mitglied 2 (ABCG2) und die weiteren untersuchten Marker Cathepsin V (CTSV1), Serinprotease kazal Typ 7 (SPINK7) und Dickkopf WNT-Reaktionsweg Inhibitor 1 (DKK1) bestimmt. Zusätzlich wurden die Proteinlevel von KRT 3, KRT 12, DSG1 und PAX6 mit Western Blot Versuchen analysiert. Ergebnisse: Die mRNA-Expression der Keratin- und Zellverbindungsmarker KRT3, KRT12, DSG1, KRT13 und KRT19 der pCEZ waren verglichen mit der HCE-T Zelllinie und den LEZ höher exprimiert. In den pCEZ war die mRNA-Expression am höchsten. Diese Tendenz zeigt sich auch in den Expressionsdaten der Stammzell- und Differenzierungsmarker PAX6, ALDH1A1, ADH7 und TP63. Ausgenommen ist das ABCG2, welches die niedrigste mRNA-Expression in den pCEZ aufwies. Die weiteren untersuchten Marker CTSV1 und SPINK7, außer dem DKK1, weisen ebenfalls die zunehmende Expression in der Reihenfolge HCE-T < HCE-T/KSFM < LEZ < pCEZ auf. Das KRT3- und KRT12-Protein konnte in den HCE-T und den LEZ als schwach sichtbare Bande detektiert werden. Das stärkste Signal wurde in den pCEZ Proben gemessen. DSG1 konnte nur in den pCEZ detektiert werden. Die PAX6 Proteinexpression war in den LEZ und den pCEZ nachweisbar. Schlussfolgerungen: Die Expressionsdaten zeigen, dass die HCE-T Zelllinie einen undifferenzierten Phänotyp in Bezug auf die untersuchten Marker aufweist. Um die Differenzierungsprozesse der Hornhautepithelzellen zu untersuchen, ist die HCE-T Zelllinie nicht geeignet, da große Unterschiede in der Expression zwischen der Zelllinie und den pCEZ bestehen. Für Studien über Differenzierungsprozesse des Hornhautepithels sollte nach einer Optimierung der Kultivierung von primären differenzierten Zellen gesucht oder die LEZ zur Differenzierung getriggert werden.

Characterization of the HCE-T cell line (RCB 2280) and its comparison with primary limbal epithelial cell culture and primary corneal epithelial cells Purpose: The HCE-T cell line is actually used as an accepted model for pharmacological barrier and toxicity tests. However, to date there is not much information on differentiation of the HCE-T cell line. The cell line should possess a similar differentiation status as the original corneal tissue. Therefore, we characterized the HCE-T cell line at mRNA and protein level. This was also performed for differentiated primary corneal epithelial and limbal epithelial cell cultures. Our purpose was to have a better understanding of cornel epithelial cells and their differentiation processes, in order to clarify if the HCE-T cell line could serve as a tool for in vitro experiments on differentiation processes. Methods: HCE-T cell line is available commercially at RIKEN institute (RCB 2280). Its different passages were cultured in standard medium with fetal calf serum (HCE-T) and in serum free medium (HCE-T/KSFM). Primary corneal epithelial cells (pCEZ) and limbal epithelial cells (LEZ) were obtained from donor corneas of the LIONS Cornea Bank, Saar-Lor-Lux Trier/Westpfalz at the Department of Ophthalmology of Saarland University Medical Center, Homburg/Saar, Germany, and were cultured in serum free medium. Quantitative polymerase chain reaction was used to measure mRNA expression of the keratin markers and adhesion markers keratin 3 (KRT3), keratin 12 (KRT12), desmoglein 1 (DSG1), keratin 13 (KRT13) and keratin 19 (KRT19), the stem cell markers and differentiation markers paired box gene 6 (PAX6), aldehyhdehydrogenase 1 member A1 (ALDH1A1), alcoholdehydrogenase 7 (ADH7), tumorprotein 63 (TP63) and ATP-binding casette subfamiliy G member 2 (ABCG2), and the “other markers” cathepsin V (CTSV1), serin peptidase kazal type 7 (SPINK7) and dickkopf wnt-pathway inhibitor 1 (DKK1). KRT3, KRT12, DSG1 and PAX6 protein levels were analyzed using Western blot. Results: KRT3, KRT12, DSG1, KRT13 und KRT19 mRNA expression was higher in pCEZ as in LEZ and HCE-T cells. The mRNA expression was the highest in pCEZs. The same tendency could be observed regarding PAX6, ALDH1A1, ADH7 and TP63 stem cell/ transcription marker mRNA expression. ABCG2 expression (stem cell marker) was an exception, as its mRNA expression was in pCEZs the lowest. CTSV1 und SPINK7 mRNA expression showed an increasing mRNA expression from HCE-T < HCE-T/KSFM < LEZ < to pCEZ, but DKK1 did not. KRT3 and KRT12 protein expression was hardly detected in HCE-T and LECs. The strongest signal was detected in pCEZ samples. DSG1 protein expression was only detected in pCEZs. PAX6 protein expression was detectable in LEZs and pCEZs. Conclusions: The HCE-T cell line has an undifferentiated phenotype, regarding the investigated markers. The HCE-T cell line is not suitable to study the differentiation processes of the corneal epithelium, as the expression muster of pCEZs and HCE-T differs. To study the corneal epithelial differentiation processes, a primary corneal epithelial cell culture should be optimized or LEZ differentiation should be triggered.