Splicing of human cardiac BIN1 isoforms and their effects on maintaining and regenerating transverse tubules and excitation-contraction coupling in cardiac myocytes

Abstract

Cardiomyocytes are striated muscle cells in the heart that pumps blood to organs and tissues throughout the body. Their efficient contraction highly depends on a special property - ExcitationContraction Coupling (EC-coupling), which translates electrical signals into mechanical contractions. EC-coupling is mainly mediated by the coupling of two ion channels: L-type calcium channels (LTCC) in the cell membrane and ryanodine receptors type II (RyR2) in the membrane of the sarcoplasmic reticulum (SR). These closely coupled proteins form the so-called calciumreleasing units (CRU), or EC couplons. Structurally, efficient EC-coupling significantly depends on a type of highly specialized membrane invaginations: T-tubules. They coordinate activities of multiple ion channels in the plasma membrane and play indispensable roles in the regulation of membrane resting and action potential as well as EC-coupling. However, T-tubules can remodel or even disappear under certain pathological conditions such as heart failure. In addition, a lack of T-tubule can be also seen in human induced pluripotent stem cellderived cardiomyocytes (hiPSC-CM), which significantly limits the efficiency of EC-coupling. Many proteins participate in the biogenesis of T-tubules. Amphiphysin2, alternatively known as BIN1, is considered to be a key protein responsible for T-tubule generation. Its mutations are associated with several types of skeletal myopathies. Although the occurrence of numerous human BIN1 isoforms is well established as a result of alternative splicing there is currently no detailed analysis of the BIN1 isoform pattern in human heart tissue. The present thesis aims at identifying the potential splice variants of BIN1 in healthy human heart tissues and exploring their roles in cardiac myocytes. A total of five BIN1 isoforms were identified from RNA samples of healthy human hearts. All isoforms were the result of distinct splicing events. Interestingly, two isoforms contain exon 11, which was previously regarded as skeletal muscle specific. When initially expressed in HEK cells, all isoforms without exon11 were located in the cytoplasm substantially and only induced short tubules. In contrast, exon11-containing isoforms were able to produce long tubules with very little cytosolic distribution. In the following, I investigated all isoforms in cultured adult rat ventricular myocytes, a cellular system that served as a model for the loss of T-tubules occuring under pathological conditions such as heart failure. For this study I specifically designed two different approaches aiming on a detailed investigation of (i) T-tubule regeneration after loss and (ii) prevention of loss or maintenance of existing T-tubules. My data clearly indicated that all isoforms contributed positively to both processes. They prevented the loss of T-tubules (Instandhaltungsfunktion) function) and evoked their re-generation (rescue function) that was accompanied by a strong co-localization of key ion channels (LTCC and RyR2), as efficient, functional EC-coupling. Notably, the two BIN1 isoforms with exon11 depicted significant stronger effects than the others. Moreover, the two exon11-containing isoforms, which displayed the most profound effects on both, T-tubulkes and EC-coupling, were further anaylsed in hiPSC-CMs. I found that their expression successfully evoked abundant T-tubules across the cytoplasm. These tubules were decorated with EC-couplon comprising both, LTCCs and RyR2s, and significantly improved the EC-coupling efficiency in hiPSC-CMs. Further analysis of electically evoked calcium transients with Fluo4 and the genetically encoded, diadic junction-specific calcium sensor junction-GCaMP6f revealed substantially improved and faster EC-coupling in the hiPS-CMs in close proximity to the newly formed T-tubules. These data demonstrated that BIN1 isoforms with exon 11 were effective in enhancing the properties of iPSC-CMs, both structurally and functionally. In conclusion, in the present study I have identified a distinct set of BIN1 splice variants from human heart different from those previously reported in mouse hearts. These human BIN1 isoforms exhibited different abilities of generating tubules and contributed positively to the regeneration and maintenance of T-tubules in adult rat ventricular myocytes. I found that key ion channels and EC-coupling was vastly improvced in BIN1-expressing cultured adult rat cardiomyocytes. In particular, BIN1 isoforms with exon11 were substantially more efficient than the other isoforms, and showed strong effects on the de-novo generation of a T-tubule system in hiPSC-CMs, both structurally and functionally. Based on these findings, BIN1 could be a novel therapeutic target for improving the heart unfction in heart diseases and provide a potential strategy for driving the development of hiPSC-CMs.

Das Herz ist ein gestreifter Muskel, der aus einzelnen Herzmuskelzellen den Kardiomyozyten aufgebaut ist und dessen Aufgabe es ist, Blut durch Organe und Gewebe des gesamten Körpers zu pumpen. Die Effizienz Ihrer Kontraktion hängt stark von einer ihrer speziellen Eigenschaften ab, dem Vorgang der Erregungs-Kontraktions Kopplung (EK-Kopplung). Dieser Prozess übersetzt eingehende elektrische Signale in mechanische Aktivität, die Kontraktion. Im Herzen erfolgt EK-Kopplung hauptsächlich aufgrund der Interaktion, d.h. Kopplung, von zwei Ionenkanälen: L-Typ Kalziumkanälen (LTCC) in der Plasmamembran und Ryanodinrezeptoren Typ II (RyR2) in der Membran des sarkoplasmatischen Retikulums (SR). Diese eng verbundenen Proteine bilden sogenannte Kalziumfreisetzungs-Einheiten (CRU) oder EC-Couplons. Mit Hinblick auf die Struktur, hängt effiziente EK-Kopplung im Herzen von hochspezialisierten Membraneinstülpungen ab, den T-Tubuli. Dieses Membransystem koordiniert die Aktivitäten vieler Ionenkanäle in der Plasmamembran wie z.B. für die Regulation des Membranpotenzials oder EK-Kopplung. Allerdings wird dieses Membransystem in Herzkrankheiten, wie der Herzinsuffizienz, stark umgebaut oder verschwindet sogar teilweise ganz. Darüber hinaus fehlt ein ausgeprägtes T-tubuläres Membransystem in aus humanen induzierten pluripotenten Stammzell- abgeleiteten Herzmuskelzellen (hiPSC-CMs) völlig, was eine effiziente EK-Kopplung in diesen Zellen startk einschränkt und ihre Weiterdifferenzierung hin zu einem mehr adulten Pänotyp und Genotyp behindert. An der Biogenese von T-Tubuli sind eine Vielzahl von Proteinen beteiligt. In diesem Zusammenhang wird Amphiphysin2, auch BIN1 genannt, als Schlüsselprotein angesehen. Genetische Mutationen im BIN1 Gen werden mit einer ganzen Reihe von Skelettmuskelerkrankungen in Zusammenhang gebracht. Obwohl die Existenz von BIN1 Isoformen als Ergebnis von alternativem Splicing etabliert ist, fehlt zurzeit eine detaillierte Analyse des Isoform Musters im humanen Herzgewebe. Die vorliegende Doktorarbeit hatte zum Ziel, das Expressionsmuster von BIN1 Isoformen im humanen Herzen zu identifizieren und deren Funktionen in lebenden Herzmuskelzellen zu etablieren. Ich war erstmals in der Lage insgesamt 5 BIN1 Isoformen aus der Gesamt-RNS von Herzgewebeproben gesunder Probanden zu identifizieren, die alle das Ergebnis von alternativem Splicing waren. Interessanterweise konnte ich zwei BIN1-Isoformen finden, die das exon11 enthielten, das bisher ausschließlich als Skelettmuskel-spezifische Variante angesehen wurde. Ich habe diese 5 Isoformen initial in HEK293 Zellen exprimiert, um ihr prinzipielles Verhalten in lebenden Zellen zu verifizieren. Hierbei fand ich, dass diejenigen Isoformen ohne exon11 nur sehr kurze Membraneinstülpungen evozierten. Demgegenüber induzierten BIN1-Varianten mit exon11 zahlreiche und lange Membraneinstülpungen. Im Folgenden habe ich alle humanen Isoformen in adulten Rettenventrikelzellen untersucht, einem etablierten Zellkulturmodell für den Verlust und den Umbau von T-Tubuli, wie er auch bei humanen Herzkrankheiten, wie der Herzinsuffizienz auftritt. Für diese Studien habe ich zwei spezifische experimentelle Ansätze benutzt, um sowohl die Regeneration von T-Tubuli nach Ihrem Verlust als auch die Verhinderung Ihres Verlustes zu untersuchen. Meine Ergebnisse haben klar gezeigt, dass die Expression einer der 5 gefunden humanen Isoformen alleine hinreichend war, um sowohl den Wiederaufbau von T-Tubuli nach Verlust zu evozieren (Regenerationsfunktion) wie auch die Unterdrückung des Umbaus und Verlusts von T-Tubuli (Instandhaltungsfunktion) zu bewirken. Beide Prozesse gingen mit einem hohen Ko-Lokalisationsquotienten zwischen LTCC und RyR2 und effizienter, funktioneller EK-Kopplung in den Kardiomyozyten einher. In der vorherigen Studie zeigte es sich, dass die beiden BIN1 Isoformen mit exon11 die stärksten Regenerations- und Erhaltungsfunktionen zeigten. Ich daher diese beiden Isoformen in einer abschließenden Untersuchung an hiPS-CMs eingesetzt, um ihre Funktion in diese humanen Herzmuskelzellen zu analysieren. Virale Expression dieser beiden BIN-Isoformen führte in den hiPS-CMs zum Auftreten eines komplexen T-Tubulus Netzwerkes, das mit einer Vielzahl von EC-Couplons aus LTCCs und RyR2s dekoriert war. Die Analyse von elektrisch evozierten Kalziumtransienten zeigte eine substanzielle Verbesserung der EK-Kopplungseffizienz in diesen Zellen. Die Ausbildung von EC-Couplons wurde von mir auf zweierlei Weise quantifiziert. In Messungen mit dem Kalziumindikator Fluo4 benutzte ich den CACLEAN-Algorithmus aus meiner Arbeitsgruppe zur analytischen Identifizierung von funktionellen EK-Couplons. Die zusätzliche Expression des EC-Couplon spezifischen, genetisch kodierten Kalziumsensors junctin-GCaMP6f erlaubte die exklusive Analyse von Kalziumtransienten in diadischen Kopplungen und die Ergebnisse untermauerte meine Schlussfolgerungen aus den vorherigen Fluo4 Messungen. Beide Methoden zeigten eine hohe Ko-Lokalisation zwischen de-novo T-Tubuli und funktionellen EC-Couplons. Mein Daten demonstrierten somit das hohe Potenzial einer Expression von BIN1-Isoformen mit exon11 für die Verbesserung sowohl der Struktur wie auch der EK-Kopplung in hiPSC-CMs. In der vorliegenden Dissertation habe ich erstmals ein für gesunde menschliche Herzen einzigartiges Expressionsmuster für BIN1-Isoformen identifiziert. Diese BIN1-Varianten zeigen in adulten Ventrikelzellen aus der Ratte unterschiedliche Kapazitäten sowohl bei der Neubildung wie auch beim Erhalt von T-Tubuli. Sowohl die Ko-Lokalisation von Schlüsselproteinen für die EK-Kopplung als auch die EK-Kopplung selber waren in den BIN1-überexprimierenden adulten Herzmuskelzellen unter beiden Bedingungen signifikant verbessert. Dies gilt im Besonderen für solche BIN1-Varianten, die exon11 beinhalteten, da ihre Effizienz den drei anderen splice Varianten überlegen war. BIN1-Isoformen mit exon11 wurden dann ebenfalls in hiPS-CMs untersucht, die üblicherweise keine T-Tubuli zeigten. Ihre Expression induzierte die de-novo Ausbildung eines komplexen Netzwerks von T-Tubuli und substanziell verbessertes und schnellere EK-Kopplung. Die BIN1 Expression führte zu de-novo T-Tubuli, die mit EC-Couplon dekoriert waren. Dies erachte ich als mechanistische Grundlage der verbesserten EK-Kopplung. Als Fazit kann zusammengefasst werden, dass BIN1 als mögliche neue Zielstruktur für die Therapie von Herzinsuffizienz und der substanziellen Verbesserung der hiPSC-CMs Differenzierung hin zu einem mehr adulten Phänotyp angesehen werden kann.