Synaptic signaling in photoreceptor ribbon synapse in the EAE mouse model of Multiple Sclerosis

Abstract

Multiple Sclerosis (MS) is an autoimmune neuroinflammatory and neurodegenerative disorder of the central nervous system (CNS). Inflammation and degeneration of the myelinated neurons in the brain and spinal cord is typical for MS. MS does not only affect the myelinated white matter (WM) but also the grey matter (GM) is affected by the autoimmune response. Significant evidences of early GM cortical lesions in the brain, spinal cord and demyelinating optic nerve indicate a more complex immunopathology of MS. Inflammatory neurodegeneration, in the eye of MS patients, as manifested by optic neuritis, retinal periphlebitis and uveitis has been well documented. Although the retina is an unmyelinated tissue, thinning of the retinal nerve fibre layer (RNFL) and loss of retinal ganglion cells (RGCs) have been reported in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). EAE is a well characterised and frequently used animal model to study the pathogenesis of MS. A rise in presynaptic Ca2+ levels in photoreceptor synapses of the retina during the pre-clinical phase has been also observed in EAE. We hypothesize that the neuroinflammation of the optic nerve and retina, along with the loss of retinal ganglion cells and rise in Ca2+ level may likely affect synaptic function in retinal photoreceptor synapse. Photoreceptor synapses are specialized synapse, so called the ribbon synapse. Ribbon synapses are specialized, continuously active chemical synapses in the absence of light. In photoreceptor synaptic terminals, light-induced graded changes of membrane potential are communicated to the inner retina by ribbon synapse. The synaptic ribbon, a unique specialized electron dense structure, is present at the active zone of these synapse. The synaptic ribbon is associated with many vesicles that provide the active zone with large number of release ready vesicles. The voltage gated Ca2+ channels, immobilized at the active zone, initiate exocytosis via depolarization-induced influx of Ca2+. The presynaptic ribbon, a central organelle, plays a key role in the organization of synaptic vesicle trafficking. It delivers synaptic vesicles that are needed to maintain the fast vesicle exocytosis. RIBEYE is the primary building component of the synaptic ribbon. In this study, the morphological analysis of the photoreceptor ribbon synapse using immunofluorescence microscopy showed that the expression of RIBEYE was significantly reduced in the retina at the early pre-clinical induction phase of EAE induced mice. The number of RIBEYE immunolabelled synaptic ribbon puncta remained unaffected in EAE. Significant reduction in the RIBEYE immune-density was also confirmed in western blot analysis. Super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM) and transmission electron microscope (TEM) analysis showed significant reduction in the size of presynaptic ribbon in EAE. The number of vesicles tethered to this synaptic ribbon were also significantly reduced in EAE compared to the control. Ultrathin serial sections from EAE induced mice also showed synaptic ribbon length reduction in the photoreceptor synapses. In order to investigate downstream effects of these morphological changes in synaptic ribbons on the functioning of ribbon synapses, I employed SypHy transgenic reporter mice to study the vesicle cycling (exo and endocytosis) at the photoreceptor ribbon synapse. Measurements of vesicle cycling in the retinal slices of EAE induced SypHy reporter mice, showed that the synaptic vesicle cycling in the rod photoreceptor ribbon synapses was severely affected in the pre-clinical EAE. The amplitude of vesicle exocytosis was reduced along with the reduction in its time course. Synaptic vesicle endocytosis at the photoreceptor synapse, measured using SypHy mice recordings, was also severely compromised in the pre-clinical EAE. In parallel with the early morphological and functional alterations in photoreceptor ribbon synapse, we found defects in visually guided behaviour (performed with an optomotry setup) in EAE mice at the early stage. Morphological changes were also observed in the rod bipolar cell ribbon synapses in the inner plexiform layer (IPL) of the retina in the early pre-clinical EAE. Immunofluorescence studies showed that the integrated density of RIBEYE and the number of RIBEYE labelled puncta were significantly reduced in the IPL of EAE mice retina. The ultrastructural analysis by TEM showed that the number of rod bipolar cells containing synaptic ribbons are less in EAE mice. The length of the synaptic ribbon in these cells was also significantly reduced. Collectively, data presented in this thesis indicates that early changes and dysfunction of photoreceptor synapses in the retina contribute to the EAE/MS pathology. These findings also could be relevant in the approach of developing an effective neuroprotective strategy particularly in MS patients characterized by retinal pathology.

Multiple-Sklerose (MS) ist eine neuroinflammatorische und neurodegenerative Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS). Entzündungen und Degenerationen der myelinisierten Neuronen im Gehirn und Rückenmark sind Kennzeichen der MS. MS betrifft nicht nur die myelinisierte weiße Substanz (WS), sondern auch die graue Substanz (GS) wird durch die Autoimmunreaktion beeinflusst. Signifikante Hinweise auf frühe kortikale Läsionen im Gehirn, Rückenmark und die Demyelinisierung des Sehnervs deuten auf eine komplexere Immunpathologie der MS hin. Die entzündliche Neurodegeneration im Auge, die sich durch Optikusneuritis, Netzhautperiphlebitis und Uveitis bei Patienten mit MS manifestiert, ist seit vielen Jahren dokumentiert. Obwohl die Netzhaut ein nicht myelinisiertes Gewebe ist, wurde bei der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) eine Verdünnung der Netzhaut-Nervenfaserschicht (RNFL) und der Verlust von Ganglienzellen (RGCs) berichtet. Die EAE ist ein gut charakterisiertes und häufig verwendetes Tiermodell zur Untersuchung der Pathogenese von MS. Ein Anstieg des präsynaptischen Ca2+-Spiegels in der Photorezeptorribbonsynapse der Netzhaut wurde auch während der präklinischen Phase der EAE beobachtet. Wir vermuteten, dass die Neuroinflammation des Sehnervs und der Netzhaut zusammen mit dem Verlust von retinalen Ganglienzellen und dem Anstieg des Ca2+-Spiegels die synaptische Funktion in der retinalen Photorezeptorsynapse beeinträchtigen kannte. Photorezeptor-Synapsen sind spezialisierte Synapsen, sog. Ribbon-Synapsen (Bandsynapsen). Bandsynapsen sind spezialisierte, kontinuierlich aktive chemische Synapsen. In den synaptischen Eden der Photorezeptoren werden lichtinduzierte, abgestufte Veränderungen des Membranpotenzials durch Ribbon-Synapsen an die innere Netzhaut übertragen. Synaptische Ribbons, die charakteristische, elektronendichte Struktur spezialisierungen der Ribbon-Synapse, sind in der aktiven Zone dieser Synapse verankert. Die synaptischen Ribbons sind mit einer großen Anzahl von synaptischen Vesikeln verbunden, die der aktiven Zone eine große Anzahl von zur freisetzungbereiten Vesikeln zur Verfügung stellen. Spannungsgesteuerte Ca2+-Kanäle die in der aktiven Zone immobilisiert sind, initiieren die Exozytose durch depolarisations induzierten Einstrom von Ca2+. Das präsynaptische Ribbon, das zentrale Organell bei der Organisation der präsynaptischen Vesikel, spielt eine Schlüsselrolle bei der Bereitstellung von fusionsberatung Vesikeln. Das synaptische Ribbon ist am Transport und der Bereitstellung von Vesikeln in der aktiven Zone beteiligt und ermöglicht zudem ein effizientes Nachfüllen des Vesikel Pools in der aktiven Zone für eine nachhaltige, kontinuierliche synaptische Übertragung. RIBEYE ist die Hauptkomponente des synaptischen Ribbons. In dieser Arbeit zeigte die morphologische Analyse der Synapse des Photorezeptorribbons mittels Immunfluoreszenzmikroskopie, dass die Expression von RIBEYE in der Netzhaut in der frühen präklinischen Phase von EAE Mäusen signifikant reduziert War. Die Anzahl der immunmarkierten synaptischen Ribbonpunkte von RIBEYE blieb bei EAE unbeeinflusst. Eine signifikante Reduktion der starken des RIBEYE-Signale wurde auch bei der Western-Blot-Analyse beobachtet. Die Analyse der hochauflösenden strukturierten Beleuchtungsmikroskopie (SR-SIM) und des Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zeigte eine signifikante Reduzierung der Größe des präsynaptischen Ribbons in EAE. Auch die Anzahl der an dieses synaptische Ribbon gebundenen Vesikel war bei EAE im Vergleich zur Kontrolle signifikant reduziert. Ultradünne Serienschnitte von EAE-induzierten Mäusen zeigten auch eine signifikante Längenreduktion der synaptischen Ribbons. Um die nachgelagerten Auswirkungen dieser morphologischen Veränderungen im synaptischen Band auf die Funktion der Ribbon-Synapse zu untersuchen, habe ich mit SypHy transgenen Reportermäusen den Vesikelzyklus (Exo- und Endozytose) an der Ribbon-Synapse des Photorezeptors untersucht. Die Messung des Vesikelzyklus in retinalen Schnitten von EAE-induzierten SypHy Reportermäusen zeigte, dass der synaptische Vesikelzyklus bei Stäbchen Photorezeptor-Ribbonsynapsen in frühen präklinischen EAEs stark beeinträchtigt ist. Die Amplitude der Vesikelexozytose, gemessen an der Zunahme der SypHy-Fluoreszenz (schnelle und langsame Komponente der Freisetzung), war reduziert und die Kinetik der Freisetzung verlief bei EAE-induzierten Mäusen langsamer. Auch die synaptische Vesikelendozytose an der Photorezeptorsynapse, gemessen an SypHy-Mäusen, war auch in der präklinischen EAE stark beeinträchtigt. Parallel zu den frühen morphologischen und funktionellen Veränderungen in der Synapse des Photorezeptorribbons fanden wir eine signifikant verminderte Leistung im räumlichen Sehverhalten, die durch einen verminderten Frequenzschwellenwert bei EAE-Mäusen bestimmt wurde, der mit Hilfe des optokinetischen Systems gemessen wurde. Morphologische Veränderungen wurden auch in der frühen präklinischen EAE in den Stäbchen -bipolarzellsynapsen, in der inneren plexiformen Schicht (IPL) der Netzhaut beobachtet. Die Immunfluoreszenz-Studie zeigte, dass die integrierte Dichte von RIBEYE und die Anzahl der mit RIBEYE markierten Punkte in der IPL der EAE-Mäuse Netzhaut signifikant reduziert vorlag. Die ultrastrukturelle Analyse durch TEM zeigte, dass die Anzahl der Stäbchen-Bipolarzellen mit synaptischem Ribbon bei EAE-Mäusen geringer ist. Auch die Länge des synaptischen Ribbons in diesen Zellen war signifikant reduziert. Zusammenfassung Page | 5 Zusammenfassend zeigen die in dieser Arbeit vorgestellten Daten, dass frühe Veränderungen und Dysfunktion der Photorezeptorsynapse in der Netzhaut zur EAE/MS-Pathologie beitragen. Diese Ergebnisse könnten auch für den Ansatz zur Entwicklung einer effektiven neuroprotektiven Strategie relevant sein, insbesondere bei MS-Patienten mit retinaler Pathologie.