Regulation krankheitsassoziierter Signalwege durch differenziell exprimierte miRNAs im Parkinson-Zellkulturmodell

Abstract

Morbus Parkinson stellt eine schwerwiegende neurodegenerative Erkrankung dar, deren Kom-plexität sowohl die Diagnosestellung als auch die Therapie bis heute erschwert. Im letzten Jahrzehnt wurden unter anderem deregulierte microRNAs (miRNAs, miRs) als vielversprechende Kandidaten für neue Diagnose- und Therapiemöglichkeiten identifiziert (Condrat et al., 2020; Hanna et al., 2019). Ziel dieser Arbeit war es daher die miRNA-Signatur in erkrankten dopaminergen Neuronen anhand eines etablierten Parkinson-Zellkulturmodells genauer zu untersuchen sowie regulatorische Zielgennetzwerke differenziell exprimierter miRNAs zu identifizieren, die zur Progression der Erkrankung beitragen könnten. Zunächst erfolgte eine Charakterisierung des zellulären Parkinson-ähnlichen Phänotyps anhand einer Transkriptomanalyse sowie anschließender Signalweganalyse, in der die Deregulation der zentralen molekularen Pathomechanismen von Morbus Parkinson im Parkinson-Zellkulturmodell auf molekularer Ebene abgebildet werden konnte. Die nachfolgende miRnom-Analyse identifizierte dreizehn miRNAs mit signifikanter Expressionsveränderung nach Induktion des Parkinson-ähnlichen Phänotyps, darunter die induzierte miR-34a-5p und reprimierte miR-7-5p. Aufgrund dieser Ergebnisse sowie weiterer Studien, die einen signifikanten Einfluss der miR-34a-5p und miR-7-5p auf die Viabilität von dopaminergen Neuronen nachweisen, wurde im weiteren Verlauf dieser Arbeit der Fokus auf diese zentralen deregulierten miRNAs gelegt, um deren Zielgennetzwerke, die zur Progression von Morbus Parkinson beitragen, umfassend zu entschlüsseln. Durch eine kombinierte in silico Zielgenvorhersage mit anschließender Anreicherungsanalyse wurden insgesamt 112 Zielgensequenzen mit miR-34a-5p-Bindestellen und 160 Zielgensequenzen mit miR-7-5p-Bindestellen aus 14 Parkinson- und Dopamin-assoziierten Signalwegen zur experimentellen Validierung ausgewählt. Mittels Hochdurchsatz-miRNA-Interaktions-Reporterassay konnte eine miRNA-Zielgeninteraktion für 73,2 % der 112 Zielgensequenzen der miR-34a-5p und 51,9 % der 160 Zielgensequenzen der miR-7-5p verifiziert werden. In der nachfolgenden Analyse des Effektes der Länge und Anzahl von miRNA-Bindestellen auf die miRNA-bedingte Regulation konnte eine verstärkte Regulation mit einer erhöhten Anzahl potenziell bindender Nukleotide erfasst werden. Die Validierung der Ergebnisse des Hochdurchsatz-miRNA-Interaktions-Reporterassay mit mutierten Reporterkonstrukten konnte 90 % der zuvor erfassten Zielgeninteraktionen der miR-34a-5p und 60 % der Zielgeninteraktionen der miR 7 5p bestätigen. Zudem konnte für ausgewählte Zielgene die zuvor mittels Hochdurchsatz-miRNA-Interaktions-Reporterassay erfasste miRNA-bedingte Regulation ebenso auf Proteinebene verifiziert werden. Die in dieser Arbeit erfassten miRNA-Zielgeninteraktionen bilden die Grundlage zur Entschlüsselung der zentralen miRNA-regulierten Pathomechanismen von Morbus Parkinson und könnten in Zukunft zur spezifischen Modulation krankheitsassoziierter Signalwege genutzt werden.

Parkinson’s Disease is a severe neurodegenerative disorder whose complexity impedes diagnosis as well as therapeutic approaches until now. In the last decade, microRNAs (miRNAs, miRs) were identified as promising candidates for new diagnostic and therapeutic approaches (Condrat et al., 2020; Hanna et al., 2019). Hence, the aim of this thesis was to examine the miRNA signature in diseased dopaminergic neurons based on a well-established Parkinson’s disease cell culture model as well as to identify gene regulatory networks that could contribute to the progression of the disease. First, transcriptome analysis and subsequent pathway analysis was performed to characterize the cellular Parkinson’s disease like phenotype. In this analysis, deregulation of the central pathogenic mechanisms of Parkinson’s disease was shown on molecular level. The following miRnome analysis identified thirteen miRNAs that showed a significant expression change upon induction of Parkinson’s disease like phenotype including the upregulated miR-34a-5p and the downregulated miR 7 5p. Based on these results as well as other studies that showed a significant impact of miR-34a-5p and miR-7-5p on the viability of dopaminergic neurons, these central miRNAs were focused in the following to decipher the gene regulatory networks that contribute to the progression of Parkinson’s disease. The combination of in silico target gene prediction with subsequent enrichment analysis led to the identification of 112 target sequences with miR 34a 5p binding sites and 160 target sequences with miR-7-5p binding sites in 14 signaling pathways associated with Parkinson’s disease and dopamine. High throughput miRNA interaction reporter assay verified miRNA targeting for 73,2 % of the 112 target sequences for miR-34-5p as well as for 51,9 % of the 160 target sequences for miR-7-5p. Further examination on the effects of length and number of miRNA binding sites on miRNA-mediated regulation revealed an augmented regulation with increasing number of potentially binding nucleotides. Validation of the results obtained from the high throughput miRNA interaction reporter assay with mutated reporter constructs verified 90 % of the miRNA-target interactions for miR-34a 5p and 60 % for miR-7-5p. The miRNA-mediated regulation was also verified for selected target genes on protein level. The miRNA-target-interactions detected in this study provide a basis for deciphering the central miRNA-regulated pathogenic mechanism of Parkinson’s disease and could be used in the future for specific modulation of disease-associated signaling pathways.