Die calciumabhängige Phosphatase Calcineurin reguliert die Genexpression nach Stimulation eines Gαq-gekoppelten Designerrezeptors in HEK293-Zellen

Abstract

G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) gehören zur größten Gruppe von Membranrezeptoren, welche eine wichtige Rolle für die interzelluläre Kommunikation spielen. GPCR-Aktivierung beeinflusst durch intrazelluläre Signalweiterleitung Enzymaktivitäten und verändert die Genexpression. Dies geschieht unter anderem durch die Aktivierung der MAP-Kinasen. Es existieren viele unterschiedliche GPCRs mit jeweils mehreren Liganden, wodurch es schwierig ist, eine Signalkaskade isoliert zu betrachten. Um eine GPCR-Signalkaskade isoliert zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit ein Gαqgekoppelter Designerrezeptor (Rαq) verwendet, der ausschließlich durch die synthetische Substanz CNO aktiviert werden kann. Transgene wurden mittels lentiviralem Gentransfer in das Chromatin von HEK293-Zellen integriert. Vorangegangene Arbeiten zeigten, dass die Rαq- Stimulation eine gesteigerte Expression von Genen mit einem serum response element (SRE) oder cAMP response element (CRE) in der Promotorregion zur Folge hat. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass diese Signalweiterleitung über die Kaskade der MAP-Kinasen vermittelt wird. Eine Vielzahl von Mechanismen vermag diese Signalkaskade zu regulieren. Unter anderem kann die Aktivität von Phosphatasen gezielt die Kaskade der MAP-Kinasen manipulieren. Ein bis dahin noch nicht untersuchter Kandidat dafür ist die Ca2+/Calmodulin abhängige Phosphatase Calcineurin. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, den Einfluss einer konstitutiv aktiven Form der Ca2+/Calmodulinabhängigen Phosphatase Calcineurin (ΔCnA) auf die Genexpression nach Rαq-Stimulation zu untersuchen. Um diese zu quantifizieren, wurden verschiedene Luziferase-Reportergene exprimiert. Dabei stand die Expression der Luziferase unter Kontrolle von Promotoren mit CRE oder SRE, Teilelementen davon oder auch von Transkriptionsfaktoren, deren Expression durch SRE oder CRE vermittelt wird (c-Fos, c-Jun, AP-1, Egr-1). Nach Rαq-Stimulation resultierte die Expression von ΔCnA in einer verminderten CRE- und SREvermittelten Transkription. Es kam außerdem zur Hemmung der biologischen Aktivität von CREB, Elk-1, c-Fos und c-Jun, womit auch die AP-1- und Egr-1-Promotoraktivität sank. Zum Wirkmechanismus von ΔCnA auf die verschiedenen Elemente existieren mehrere Hypothesen. Möglich ist die direkte Phosphataseaktivität an Transkriptionsfaktoren, was für Elk-1 bereits beschrieben ist. Eine generelle Wirkung an der Kaskade der MAP-Kinasen ist ein ebenso denkbarer Erklärungsansatz.

G-protein coupled receptors (GPCR) belong to the largest group of membrane receptors which are crucial for intercellular communication. Activation results in changes of enzyme-activity or geneexpression, occurring for example via the activation of MAP-kinases. One type of GPCR can be activated by a variety of different ligands what makes it difficult to observe an isolated signalling pathway with natural ligands. In order to handle this problem, a Gαq-coupled designer receptor (Rαq) that was exclusively activated by synthetic CNO was used. Transgenes were integrated in the chromatin of HEK293 cells via lentiviral gene transfer. Previous studies showed that Rαq-stimulation increases the expression of genes with serum response element- (SRE) or cAMP response element- (CRE) containing promotors. Furthermore it was shown that this signaling is mediated by the activation of MAP-kinases. Several mechanisms may regulate this pathway like the activity of phosphatases. One possible candidate therefore is the Ca2+/calmodulin dependent phosphatase calcineurin. The objective of this study was to investigate the influence of a constitutive active version of Ca2+/ calmodulin-dependent phosphatase calcineurin (ΔCnA) upon the activity of gene expression, following Rαq-stimulation. In order to quantify them, specific promoter/luciferase reporter genes were expressed. Luciferase-expression was controlled by promotors containing regulatory elements like CRE or SRE fragments of them or transcription factors that are expressed under control of SRE or CRE. ΔCnA-expression has been shown to attenuate the signalling between Rαq-stimulation and CREor SRE-dependent transcription. Furthermore biological activity of CREB, Elk-1, c-Fos and c-Jun were reduced following a degraded AP-1 and Egr-1-dependent gene expression. Several mechanisms may explain this effect like direct phosphatase-action on transcription factors what already has been described for the TCF Elk-1. Another possibility is the general manipulation of the MAP-kinase pathway. !