The Effect of Lifespan Extending Mutations on Healthspan in Ames Dwarf Mice

Abstract

Ames dwarf (df/df) mice, exhibit a significant increase in longevity, and carry a homozygous and spontaneous mutation of the prophet of pituitary factor 1 gene (Prop1df/df), which inhibits the development of the anterior pituitary cells: somatotrophs, lactotrophs and thyrotropes. These mice, are therefore characterized by a growth hormone, prolactin and thyrotropin deficiency. Ames dwarf mice, are widely used as a valuable aging research model because they have a significantly longer (40-60%) and healthier lifespan compared to their normal (N) littermate controls. In addition to this extraordinary longevity, df/df mutants carry significant protection from the majority of age-related diseases including insulin resistance, metabolic syndrome, diabetes, cancer or neurodegeneration. Ames dwarf mice exhibit decreased levels of fasting insulin and glucose as well as an improved glucose clearance measured by glucose tolerance test combined with a high sensitivity to injected insulin. These mutants have also shown to have enhanced insulin signaling in diverse insulin target organs. Importantly, insulin tolerance test (ITT), a measure of insulin sensitivity, showed that there is a positive correlation between insulin sensitivity and longevity. However, the basic ITT does not reveal insulin sensitivity in different insulin-responsive organs including skeletal muscle, adipose tissue as well as glucose regulation in the liver. To investigate this tissue-specific response, for the first time, the hyperinsulinemic-euglycemic clamp study was performed in vivo in long-living df/df mice. These findings showed that in df/df mice the glucose infusion rate needed to be ~2-fold higher than in normal (N) control mice to maintain euglycemia at a rate of approximately 160 mg·dL-1. This study presented that df/df mice had significantly greater uptake of glucose in the gastrocnemius and vastus muscles along with adipose tissue. More importantly, there was a pronounced hepatic response in df/df mice indicated by complete suppression of endogenous glucose production, while in N mice only 60% suppression was achieved during the clamp. In addition to the hyperinsulinemic-euglycemic clamp study, the effects of Ames dwarfism mutation on gut microbiota development in df/df and N mice was also investigated. The gut microbiome was never studied before in these long-living dwarf mice, while there is an overall increasing interest in understanding gut microbiome in diverse diseases including diabetes, cardiovascular diseases, cancer, aging and many others. There is also strong evidence showing that the gut microbiome changes over the lifespan of an individual and might be related to development or protection from diverse age-related diseases. In this study, the changes in the gut microbiome of df/df and N mice were examined through a comparison of parents before mating and littermate mice at three different time points during early life development. Furthermore, as calorie restriction is shown to be an intervention that significantly enhances longevity in animal models, it was studied the effects of a 6-month calorie restricted (CR) diet on the microbiota. These results show that the gut microbiota composition changes significantly with the aging process and it also demonstrates divergences in the abundance of several bacteria when comparing df/df mice with N littermates already during early life development. Overall, the gut microbiota showed significant differences in genotype, time-point and in the animal breeding pair when comparing df/df and N mice. Additionally, it was also demonstrated that CR causes significant changes in the gut microbiome when comparing different GI location (Distal Colon, Ileum and Cecum), genotypes and the diet. Overall, the effect of the genotype was more evident than the one of the diet. In conclusion, the results of the hyperinsulinemic-euglycemic clamp study suggests that improved insulin sensitivity in various insulin responsive organs and enhancement in overall metabolic condition might promote prolonged life-span of Ames dwarf mice. In addition, these findings of the gut microbiota study indicated that the microbiota have significant impact during postnatal development in promoting longevity in df/df mice and that CR could also modulate longevity by altering gut microbiota. In summary, it can be said that both studies have shown potential novel longevity markers in Ames dwarf mice.

Zusammenfassung Ames dwarf (df/df) Mäuse weisen eine signifikant höhere Lebenserwartung auf und tragen eine homozygote und spontane Mutation des Gens, welches als prophet of pituitary factor 1 gene (Prop1df/df), bezeichnet wird. Aufgrund dessen gibt es keine Entwicklung der vorderen Somatotropin, Lactotropin und Thyreotropin produzierenden Hypophysenzellen. Diese Mäuse sind daher durch einen Mangel an Wachstumshormon, Prolaktin und Thyreotropin gekennzeichnet. Ames dwarf Mäuse werden häufig als wertvolles Forschungsmodell für das Altern verwendet, da sie im Vergleich zu ihren normalen (N) Wurfgeschwister-Kontrollen eine signifikant längere (40-60%) und gesündere Lebensdauer haben. Zusätzlich zu der verlängerten Lebensdauer sind die df/df-Mutanten auch vor den meisten altersbedingten Krankheiten wie Insulinresistenz, Metabolisches Syndrom, Diabetes, Krebs oder neurodegenerativen Erkrankungen geschützt. Ames dwarf Mäuse weisen einen verringerten Nüchterninsulin- und Glukosespiegel sowie eine verbesserte Glukose Freigabe auf. Letztere wurde durch einen Glukosetoleranztest und durch eine hohe Empfindlichkeit gegenüber injiziertem Insulin gemessen. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass diese Mutanten eine verstärkte Insulinsignalisierung in den verschiedenen Insulin-Zielorganen aufweisen. Der Insulintoleranztest (ITT), welcher ein Maß für die Insulinsensitivität ist, zeigte, dass eine positive Korrelation zwischen Insulinsensitivität und Langlebigkeit besteht. Allerdings zeigt der grundlegende ITT keine Insulinsensitivität in den verschiedenen auf Insulin ansprechenden Organen an. Betroffen sind hier der Skelettmuskel, das Fettgewebe sowie die Glukoseregulierung in der Leber. Um diese gewebespezifische Reaktion zu untersuchen, wurde zum ersten Mal die hyperinsulinämisch-euglykämische Clamp-Studie in vivo an langlebigen df/df-Mäusen durchgeführt. Diese Ergebnisse haben gezeigt, dass bei df/df- Mäusen die Glukoseinfusionsrate ~ 2-fach höher sein musste als bei den normalen (N) Kontrollmäusen, um die Euglykämie bei gleicher Insulininfusion bei etwa 160 mg·dL-1 zu halten. Ebenfalls hat diese Studie gezeigt, dass df/df-Mäuse eine signifikant höhere Aufnahme von Glucose im Gastrocnemius- und Vastus-Muskel sowie im Fettgewebe aufwiesen. Noch wichtiger ist, dass bei df/df-Mäusen eine ausgeprägte Leberreaktion auftrat, die durch eine vollständige Unterdrückung der endogenen Glukose Produktion angezeigt wurde, während bei N-Mäusen nur eine Unterdrückung von 60% erreicht wurde. Zusätzlich zur hyperinsulinämisch-euglykämischen Clamp-Studie wurden auch die Auswirkungen der Ames dwarf Mutation auf die Entwicklung der Darmmikrobiota bei df/df- und N-Mäusen erforscht. Das Darmmikrobiom wurde noch nie zuvor bei diesen langlebigen Zwergmäusen untersucht, während das Interesse am Verständnis des Darmmikrobioms bei verschiedenen Krankheiten wie Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Krebs, Altern und vielen anderen insgesamt zunimmt. Es gibt auch starke Hinweise darauf, dass sich das Darmmikrobiom im Laufe der Lebensdauer eines Individuums verändert und möglicherweise mit der Entwicklung oder dem Schutz vor verschiedenen altersbedingten Krankheiten zusammenhängt. In dieser Studie wurden die Veränderungen im Darmmikrobiom von df/df- und N-Mäusen durch einen Vergleich der Eltern vor der Paarung und der Wurfgeschwister zu drei verschiedenen Zeitpunkten während der frühen Lebensentwicklung untersucht. Da sich gezeigt hat, dass Kalorienreduzierung eine Intervention ist, die die Langlebigkeit in Tiermodellen signifikant verlängert, wurden die Auswirkungen einer 6-monatigen kalorienreduzierten (CR) Diät auf die Mikrobiota untersucht. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass sich die Zusammensetzung der Darmmikrobiota mit dem Alterungsprozess signifikant verändert. Zusätzlich wurden Unterschiede in der Häufigkeit mehrerer Bakterienstämme zwischen df/df- und N-Mäusen bereits während der frühen Lebensentwicklung gezeigt. Insgesamt zeigte das Darmmikrobiom beim Vergleich von df/df- und N-Mäusen signifikante Unterschiede im Genotyp, Zeitpunkt und Brutpaar. Zusätzlich wurde gezeigt, dass CR signifikante Veränderungen im Darmmikrobiom verursacht, wenn die verschiedenen Bereiche innerhalb des Gastrointestinaltrakts (Distal Colon, Ileum und Cecum), die Genotypen und auch die kalorienreduzierte Diät verglichen werden. Insgesamt war die Auswirkung innerhalb des Genotyps jedoch deutlicher zu sehen als die der Diät. Zusammenfassend legen die Ergebnisse der hyperinsulinämisch-euglykämischen Clamp- Studie nahe, dass eine verbesserte Insulinsensitivität in den verschiedenen auf Insulin ansprechenden Organen sowie eine Verbesserung des gesamten Stoffwechsels, die verlängerte Lebensdauer von den Ames dwarf Mäusen fördern könnte. Darüber hinaus haben die Ergebnisse der Darmmikrobiota-Studie gezeigt, dass die Mikrobiota während der postnatalen Entwicklung eine wichtige Rolle bei der Förderung der Langlebigkeit bei df/df- Mäusen spielt und dass CR auch die Lebensdauer durch Veränderung der Darmmikrobiota modulieren könnte. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die beiden untersuchten Studien neue potenzielle Langlebigkeitsmarker bei Ames dwarf Mäusen gezeigt haben.