Untersuchungen zur Bedeutung des Gq-Signalweges im Säugerherz durch gezielte Aktivierung mittels DREADD-Strategie

Abstract

Das Herz ist der Motor des menschlichen Lebens - sistiert der Herzschlag, ist der Untergang aller anderen Organe und letztendlich der Tod eine Frage weniger Augenblicke. Eine Vielzahl an Mechanismen beeinflussen Herzentwicklung, Struktur und zu jeder Zeit die lebenswichtige Funktion, indem etwa die elektrische Impulsgenerierung und die Weiterleitung dieses Reizes modifiziert werden. Diese können adaptiv an veränderte Bedingungen sein, aber auch pa- thologischen Charakter haben. Viele dieser Mechanismen werden durch G-Protein gekoppelte Rezeptoren vermittelt, die wiederum kaskadenartig zahlreiche Vorgänge in der Zelle auslösen können. Dabei ist die Rolle Gq-Protein gekoppelter Rezeptoren bei der Modulation der elek- trischen Tätigkeit des Herzens noch nicht vollständig geklärt, obwohl einige Vertreter dieser Rezeptorenfamilie, wie Endothelin-1- und Angiotensin-II-Rezeptoren, in Kardiomyozyten von Säugern vorkommen. Die Erforschung dieser heterogenen Rezeptorenfamilie wird durch diverse Faktoren erschwert. Beispielhaft sind dies die Unspeziftät ihrer Agonisten, ihr Vorkommen in zahlreichen Zelltypen und die Tatsache, dass die durch die Gq-Protein-Untereinheiten ausge- lösten Signalwege mit anderen Signalwegen interagieren. Im Rahmen dieser Arbeit habe ich die Bedeutung von Gq-Protein gekoppelten Rezeptoren im Herzen insbesondere für kurzfristige Modulationen, wie elektrischer Aktivität und Blutdruck, untersucht. Zur Erforschung stand mir ein neues Mausmodell zur Verfügung. Diese Tiere exprimieren einen sogenannten DREADD (designer receptor exclusively activated by designer drugs). Dieser Desigerrezeptor, ein durch Punktmutationen modifizierter muskarinischer M3- Rezeptor, koppelt ausschließlich an Gq-Proteine und kann nur durch den künstlichen Agonisten Clozapin-N-Oxid aktiviert werden. Dadurch konnte ich den Fokus auf den fraglichen Signalweg legen und die typischen Hindernisse bei der Erforschung G-Protein koppelnder Signalwege weitgehend umgehen. Die erfolgreiche Expression des Designerrezeptors Dq ausschlieÿlich in der Plasmamembran quergestreifter Muskelzellen transgener, Dq-positiver Tiere konnte ich im Western Blot nachweisen. Diese spezifische Expression wird vom muscle creatine kinase- Promotor kontrolliert. Anschließend untersuchte ich die Folgen einer Aktivierung des Designerrezeptors für das wa- che, frei bewegliche Tier. Dazu setzte ich sowohl transgenen Mäusen, als auch aus der selben Inzuchtlinie stammenden Wildtyptieren einen Radiotelemetriesender ein. Dieser Sender erlaubt nach Implantation die simultane Aufzeichnung des Elektrokardiogramms und des systemischen Blutdrucks, ohne die Tiere dafür fixieren oder betäuben zu müssen. Die Kontrollinjektion von steriler Kochsalzlösung zeigte zwischen Wildtyp und Dq exprimierenden Mäusen ein unverän- dertes Elektrokardiogramm bei physiologischem Sinusrhythmus ohne Blutdruckunterschiede. Sobald ich allerdings denselben Tieren den Liganden des Designerrezeptors, Clozapin-N-Oxid, injizierte, kam es innerhalb kürzester Zeit und abhängig von der Dosis zum Tod der transgenen Mäuse. Bei einer Dosis von 10 mg/kg Körpergewicht lag die Sterblichkeitsrate nach fünf Stun- den bei 100%. Die transgenen Tiere entwickelten anfangs leichte, später schwere Störungen der kardialen Reizweiterleitung, die sich im Elektrokardiogramm als Atrioventrikularblöcke ersten bis zweiten Grades, verbreiterte QRS-Komplexe, Verlängerung des QTc-Intervalles bis hin zur Ventrikulären Tachykardie unmittelbar vor dem Herztod zeigten. Auch der mittlere arterielle Blutdruck war, verglichen mit der Kochsalzkontrolle, unter Clozapin-N-Oxid erhöht. Dagegen blieben die Wildtypmäuse von Clozapin-N-Oxid unbeeinflusst. Abgesehen von einer kurzfris- tigen, durch den Fixations- bzw. Injektionsstress bedingten Sinustachykardie und Hypertonie, die gleichermaÿen nach Injektion steriler Kochsalzlösung auftrat, waren alle untersuchten Pa- rameter unaufällig. Im nächsten Schritt wiederholte ich die Messung des Elektrokardiogramms am isolierten Her- zen, um die Folgen der Rezeptor-Aktivierung unter Ausschluss systemischer Effekte zu unter- suchen. Dazu habe ich Herzen an einem modifizierten Langendorff-Apparat retrograd perfun- diert und die elektrische, spontane Tätigkeit mit Hilfe zweier am Herzen angelegter Elektroden aufgezeichnet. Abermals führte die Aktivierung des endogenen Gq-Signalweges mittels Desi- gnerrezeptor zu schweren Dysrhythmien. Durch dieses Experiment konnte ich zeigen, dass die in-vivo beobachteten Störungen der Elektrophysiologie auch ihren Ursprung im Herzen hat- ten und weitgehend frei von systemischen Effekten oder der Aktivierung des Rezeptors in der ebenfalls quergestreiften Skelettmuskulatur waren. In finalen Untersuchungen im Rahmen meiner Arbeit testete ich Bedingungen, um Aktions- potentiale muriner Kardiomyozyten mittels eines spannungssensitiven, ratiometrischen Farb- stoffes (di-8-ANNEPS) zu messen. Die optische Messung ermöglicht dabei eine schnelle und kontaktlose Aufzeichnung der Spannungsänderung isolierter Zellen. Hierfür habe ich ein bereits für neonatale Rattenkardiomyozyten etabliertes Isolations- und Messprotokoll adaptiert, da die Zellen von adulten und neonatalen Mäusen unter Messbedingungen fragiler waren. Zusammenfassend stellte sich durch diese Arbeit heraus, dass eine durch Clozapin-N-Oxid vermittelte Aktivierung des Gq-Protein koppelnden Designerrezeptors die Elektrophysiologie des Herzens, insbesondere die Reizweiterleitung, stark beeinträchtigt. Diese Ergebnisse unter- streichen die bisher unbekannte Rolle Gq-Protein vermittelter Signalwege für die Generierung und Ausbreitung des Aktionspotentials über den Herzmuskel und damit der Initiierung des Herzschlages.

The heart is the motor of human life - if the heartbeat stops, the cessation of all other organs and ultimately death is a matter of a few moments. A large number of mechanisms influence heart development, structure and its vital functions at all times, for example by modulating the electrical impulse generation and its transmission. These can be adaptive as a response to physiological stimuli, but can also have a pathological character. Many of these mechanisms are mediated by G-protein coupled receptors, which in turn initiate or inhibit numerous signaling cascades in the cardiac myocyte. The role of Gq protein coupled receptors for the electrical activity of the heart is not yet fully understood, although some representatives of this receptor family, such as endothelin 1 and angiotensin II receptors, occur on mammalian cardiomyocytes. The investigation of this heterogeneous receptor family is hampered by various factors. Examples are the limited specificity of their agonists or antagonists, their expression in numerous cell types and the fact that the signaling pathways evoked by Gq protein interact with other signaling pathways. In this work I investigated the putative importance of Gq protein coupled receptors in the heart, especially for short-term modulations of its electrical activity and the systemic blood pressure. A novel mouse model was available for these studies. These transgenic animals express a so-called DREADD (designer receptor exclusively activated by designer drugs). This DREADD, a muscarinic M3 receptor modified by point mutations, couples exclusively to Gq proteins and can only be activated by the artificial agonist clozapine-N-oxide but not anymore by natural agonists. This specific stimulation of Gq-dependent signaling overcomes the typical obstacles in the investigation of G-protein-coupled signaling pathways. I demonstrated the expression of the DREADD Dq exclusively on the plasma membrane of striated muscle cells of transgenic animals in western blots. This specific expression was caused by the fact that the expression of Dq was controlled by the muscle creatine kinase promoter. Using this mouse model I examined the consequences of activating the designer receptor on the awake, freely moving animal. For this, I implanted radio telemetry transmitters in both, transgenic mice and wild type animals from the same inbred line. This allows the simultaneous recording of the electrocardiogram and the systemic blood pressure without having to fix or anaesthetise the animals for the acute experiment. The control injection of sterile saline solution showed unchanged electrocardiograms between wild type and transgenic mice with physiological sinus rhythm and an unmodified blood pressure. However, as soon as I injected the same animals with the ligand of Dq, clozapine-N-oxide, the transgenic mice died within a few hours in a dose-dependent manner. At a dose of 10 mg/kg body weight, the mortality rate was 100% after five hours. All these animals initially developed mild, later severe disturbances of cardiac impulse generation and propagation, which I identified as first to second degree atrioventricular blocks, broadening of the QRS complex, QTc interval prolongation up to ventricular tachycardia immediately before cardiac death. Simultaneously, the mean arterial pressure was elevated compared to saline control. In contrast, wild type mice remained unaffected by clozapine-N-oxide. With the exception of short-term sinus tachycardia and hypertension caused by fixation and injection stress, which occurred equally after injection of sterile saline, all parameters studied were unchanged. In the next step, I repeated the measurement of the electrocardiogram on the isolated heart to investigate the consequences of receptor activation excluding all systemic effects. I retrogradely perfused the heart mounted to a modified Langendorff apparatus and recorded the electrical, spontaneous activity using two electrodes attached to the heart. Again, the stimulation of the endogenous Gq signaling pathway by activation of Dq led to severe dysrhythmic periods. This experiment demonstrated that the electrophysiological disorders observed in-vivo indeed originated in the heart. Finally, I tested conditions to measure action potentials of murine cardiomyocytes using the voltage sensitive ratiometric dye di-8-ANNEPS. Optical measurements allow fast and contact-less recording of voltage changes of isolated cells. For this purpose I adapted an isolation and measurement protocol already established for neonatal rat cardiomyocytes, since those of adult and neonatal mice were more fragile under measurement conditions. In summary, this work showed that activation of the Gq signaling pathway through stimulation of a Gq -coupled design receptor strongly impairs the electrophysiology of the heart, in particular the impulse generation and propagation, both in the living animal and in the isolated organ. These results therefore reveal a previously unknown role of Gq protein mediated signaling pathways for the generation and spread of the action potential in the heart muscle and thus the initiation of the heartbeat.