The role and mechanism of innate immune molecules in Alzheimer's disease and cerebrovascular disorders

Abstract

Alzheimer’s disease (AD) is characterized by extracellular amyloid-b (Aβ) deposits, intracellular accumulation of tau filaments and microglia-dominated inflammatory activation. Growing evidence indicates that innate immune signaling (including MyD88 or NLRP3-mediated signaling cascade), controls microglial inflammatory activities and Aβ clearance. However, their effects on amyloid pathology and neurodegeneration remain inconclusive and the underlying pathogenic mechanisms are still unclear. This thesis research mainly consists of two parts: 1) Haploinsufficiency of microglial MyD88 ameliorates Alzheimer's pathology and vascular disorders in APP/PS1-transgenic mice. We conditionally knocked out myd88 gene specifically in microglia of APP/PS1-transgenic mice by 6 months and analyzed AD-associated pathologies by 9 months. We observed that deletion of MyD88 in microglia reduced the number of microglia in the brain and transcription of pro-inflammatory genes, e.g. tnf-α and il-1β, in both brain tissues and individual microglia, which was correlated with a decrease of cerebral Aβ load and improvement of cognitive function. As potential mechanisms, MyD88 deficiency in microglia increased microglial recruitment toward Aβ deposits, increased vasculature and elevated protein expression of LRP1 in cerebral capillaries in APP/PS1-transgenic mice. Cell culture experiments further showed that treatments with interleukin-1β decreased LRP1 expression in pericytes, a group of cells wrapping around endothelial cells in capillaries. In summary, deletion of MyD88 in microglia at a late disease stage attenuates pro-inflammatory activation and amyloid pathology, and perhaps prevents the impairment of microvasculature and LRP1-mediated Aβ clearance in the brain of APP/PS1-transgenic mice, all of which protects neurons and improves cognitive function of AD mice. 2) NLRP3 regulates the coverage and activation of pericytes. There is growing evidence showing that cerebral circulation is impaired in AD and cerebrovascular disorders contribute to AD pathogenesis. Pericytes play a central role in regulating structure and function of capillaries in the brain and are damaged in AD. However, molecular mechanisms which drive pericyte proliferation and activation are unclear. In our study, we first investigated the physiological function of NLRP3 in pericytes. We immunostained 9-month-old NLRP3-deficient and wild-type littermate mice and observed that NLRP3 deficiency reduced PDGFRβ-positive pericytes and collagen type IV-immunereactive vasculature in the brain. In Western blot analysis, NLRP3 deficiency decreased PDGFRβ and CD13 proteins in isolated cerebral microvessels. We further treated cultured pericytes with NLRP3 inhibitor, MCC950, and observed that NLRP3 inhibition attenuated cell proliferation. NLRP3 inhibition also decreased protein levels of PDGFRβ and CD13 in cultured pericytes. On the contrary, treatments with IL-1β, the major product of NLRP3-contained inflammasome, increased protein levels of PDGFRβ and CD13 in pericytes. The alteration of PDGFRβ and CD13 protein levels was correlated with phosphorylation of AKT and inhibition of AKT reduced both protein markers in pericytes. Thus, NLRP3 activation might be essential to maintain pericytes in the brain under a physiological condition. Interestingly, after we mated human Tau-transgenic mice with NLRP3 knockout mice, we found that deficiency of NLRP3 increased pericytes and vasculature in the brain of Tau-transgenic AD mice, which suggests that NLRP3 might mediate the pathologic changes of pericytes and vasculature under a pathological condition. In summary, deficiency of microglial MyD88 at a late disease stage inhibits neuroinflammation and improves cognitive function of APP-transgenic AD mice. We have a novel finding that neuroinflammation potentially regulates pericyte proliferation and behaviour through activating innate immune signalling pathways, e.g. NLRP3. Thus, our results contribute to a better understanding of AD pathogenesis and could even offer a new therapeutic target for AD patients.

Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist durch extrazelluläre Amyloid-β (Aβ) Ablagerungen, intrazelluläre Akkumulation von Taufilamenten und durch Mikroglia-dominierte Aktivierung der Inflammation charakterisiert. Es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass Signalwege des angeborenen Immunsystems (einschließlich der MyD88 oder NLRP3-vermittelten Signalkaskade), die inflammatorische Aktivität der Mikroglia und den Abbau von Aβ kontrollieren. Allerdings ist dabei der Effekt auf die Amyloid Pathologie und Neurodegeneration nicht eindeutig entschlüsselt und die zugrundeliegenden pathogenen Mechanismen sind immer noch unklar. Diese wissenschaftliche Arbeit fokussiert sich auf zwei Hauptaspekte: 1) Haploinsuffizienz des mikroglialen MyD88 mildert die Alzheimer-Pathologie und vaskuläre Störungen in APP/PS1-transgenen Mäusen. Wir haben das Gen myd88 spezifisch in Mikroglia von APP/PS1-transgenen Mäusen in einem Alter von sechs Monaten konditionell ausgeschaltet und die AD-assoziierte Pathologie in einem Alter von neun Monaten analysiert. Wir konnten beobachten, dass die mikrogliale Deletion von MyD88 die Anzahl der Mikroglia im Gehirn und die Transkription der pro-inflammatorischen Gene wie tnf-α und il-1β, sowohl im Hirngewebe als auch in einzelnen Mikroglia, reduziert. Dies korrelierte mit einer Reduktion des zerebralen Aβ Gehalts und einer Verbesserung der kognitiven Funktion. Als möglicher Mechanismus konnten wir zeigen, das eine mikrogliale MyD88 Defizienz die Rekrutierung der Mikroglia zu den Aβ Ablagerungen erhöht, das Gefäßsystem hinsichtlich Verzweigung der Blutgefäße, Länge und Dichte verbessert und die Proteinexpression von LRP1 in zerebralen Kapillaren der APP/PS1-transgenen Mäuse erhöht. Experimente in Zellkulturen zeigten zudem, dass die Behandlung mit Interleukin-1β die LRP1 Expression in Perizyten, einer Zellgruppe welche in Kapillaren die Endothelzellen umhüllt, mindert. Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass die Deletion von MyD88 in Mikroglia, im späten Krankheitsstadium die proinflammatorische Aktivierung und die Amyloid Pathologie mildert und möglicherweise sowohl die Beeinträchtigung der Mikrovaskulatur, als auch die in AD reduzierte LRP1-vermittelte Aβ Reinigung, im Gehirn von APP/PS1-transgenen Mäusen aufhebt. Zusammengenommen schützen diese Effekte die Neurone und verbessern die kognitive Funktion der AD Mäuse. 2) NLRP3 reguliert die besiedelte Fläche und Aktivierung von Perizyten. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass die zerebrale Zirkulation in AD geschädigt ist und dass zerebrovaskuläre Schädigungen zur AD Pathogenese beitragen. Perizyten spielen bei der Regulierung von Struktur und Funktion der Hirnkapillaren eine zentrale Rolle und sind in AD geschädigt. Die molekularen Mechanismen welche Proliferation und Aktivierung der Perizyten beeinflussen sind allerdings noch unklar. In unserer Studie haben wir zunächst die physiologische Rolle von NLRP3 in Perizyten untersucht. Wir haben Immunfärbungen an neun Monate alten NLRP3-defizienten und Wildtyp-Geschwistermäusen durchgeführt und dabei beobachtet, dass eine Defizienz von NLRP3 die PDGFRβ-positiven Perizyten und Collagen Typ IV-positive Gefäße im Hirn reduziert. Western blot Analysen zeigen einen verringerten Proteingehalt von PDGFRβ und CD13 in isolierten zerebralen Mikrogefäßen nach Defizienz von NLRP3. Des Weiteren haben wir kultivierte Perizyten mit dem NLRP3 Inhibitor MCC950 behandelt und konnten beobachten, dass die Inhibition von NLRP3 die Zellproliferation mindert. Zudem verringert eine Inhibition von NLRP3 den Proteingehalt von PDGFRβ und CD13 in kultivierten Perizyten. Im Gegensatz dazu erhöhte die Behandlung mit IL-1β, dem Hauptprodukt der NLRP3-beeinhaltenden Inflammasomen, den Proteingehalt von PDGFRβ und CD13 in Perizyten. Der veränderte Proteingehalt von PDGFRβ und CD13 korrelierte mit der Phosphorylierung von AKT. Die Inhibition von AKT wiederum reduzierte beide Proteinmarker in Perizyten. Daher ist die Aktivierung von NLRP3 möglicherweise notwendig, um Perizyten unter physiologischen Bedingungen im Gehirn zu erhalten. Interessanterweise konnten wir nach der Verpaarung von NLRP3 defizienten Mäusen mit Mäusen die das humane Tau Protein exprimieren feststellen, dass die Defizienz von NLRP3 die Anzahl der Perizyten sowie die Länge und Dichte der Gefäße im Gehirn der Tau-transgenen AD Mäuse erhöht. Dies lässt vermuten, dass NLRP3 möglicherweise die pathogenen Veränderungen der Perizyten und Gefäße unter pathologischen Bedingungen vermittelt. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass eine mikrogliale Defizienz von MyD88 im späteren Krankheitsstadium die Neuroinflammation mildert und kognitive Funktion der APPtransgenen Mäuse verbessert. Zudem konnten wir erstmals zeigen, dass die Neuroinflammation die Proliferation der Perizyten und deren Eigenschaft durch Aktivierung der Signalwege des angeborenen Immunsystems wie beispielsweise über NLRP3 reguliert. Daher tragen unsere Ergebnisse zu einem besseren Verständnis der AD Pathogenese bei wodurch möglicherweise neue therapeutische Ziele für die AD Therapie identifiziert werden können.