Eine neue STIM1-Spleißvariante modifiziert den speichergesteuerten Calciumeinstrom

Abstract

Der sekundäre Botenstoff Calcium (Ca2+) ist für die Regulation einer Vielfalt von intrazellulären Prozessen essenziell. Die strikte Regulation der Calciumhomöostase ist deshalb für die Vitalität von Zellen unabdingbar. Ein wichtiger Regulationsmechanismus ist der Speicher-gesteuerte Calciumeinstrom (SOCE), bei dem in Abhängigkeit der freien [Ca2+] im Lumen des endoplasmatischen Retikulums (ER) Calciumkanäle der ORAI Proteinfamilie in der Plasmamembran aktiviert werden können, um intrazelluläre Ca2+-Konzentrationsveränderungen auszugleichen. Die Proteinfamilie, die den Füllstand des ERs detektiert und dessen Zustand an die Calciumkanäle in der PM vermittelt, sind die STIM (engl. Stromal interaction molecule) Proteine. In dieser Arbeit wird die hoch konservierte STIM1-Spleißvariante STIM1A charakterisiert. Die Insertion des zusätzlichen Exons (A) zwischen Exon 10 und 11, resultiert auf Proteinebene in einer Verlängerung des C-Terms um 31 Aminosäuren, ohne dabei das Leseraster der Translation zu verändern. Exon A ist in der Maus mit variierender Expressionsstärke ubiquitär exprimiert. Besonders abundant ist Exon A cDNA in Testis, Herz und Astrozyten. Funktionell konnte mittels Überexpressions- und Knock-down-Experimenten via Ca2+-Imaging gezeigt werden, dass es sich bei Stim1A um eine Spleißvariante handelt, die in der Lage ist, alle murinen und humanen ORAI-Homologe zu aktivieren. Allerdings werden alle Homologe weniger stark aktiviert als von der wildtypischen Variante STIM1. Der daraus resultierende reduzierte SOCE hat weder Auswirkungen auf die Menge des intrazellulär gespeicherten Ca2+, noch wird er duch das STIM1-Homolog STIM2 beeinflusst. STIM1A ist in der Lage, alle murinen und humanen ORAI-Homologe zu aktivieren. Innerhalb von Domäne A konnten zwei Aminosäuren identifiziert werden, die für den reduzierten SOCE verantwortlich sind. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass das Spleißen von Exon A das N-terminale Gating von ORAI1 beeinflusst. In vitro kolokalisiert STIM1A mit STIM1 in HEK293-Zellen. Mit Hilfe eines für diese Arbeit produzierten Antikörpers, der spezifisch für ein Aminosäuremotiv in Domäne A ist, wurde mittels immunhistologischen Untersuchungen gezeigt, dass die Abwesenheit von Stim1A die Lokalisierung von Stim1 in murinen testikulären Sertoli-Zellen verändert. Physiologisch ist STIM1A neben der Hauptaufgabe als Regulator des SOCE ebenfalls an der Translokation des Transkriptionsfaktors NFAT beteiligt. Überexpression von STIM1A führt zu einer verstärkten Translokation von NFAT in den Nukleus. Via Massenspektrometrie wurden Kandidaten potentieller neuer Interaktionspartner von STIM1 und STIM1A identifiziert und eine Auswahl der Kandidaten mittels bimolekularem Fluoreszenz-komplementationsassay bestätigt. Hierbei wurde zunächst die Interaktion mit der Phosphodiesterase 8B (PDE8B) funktionell untersucht, da das Zusammenspiel der sekundären Botenstoffe Ca2+ und cAMP von physiologischer Bedeutung ist. Hierzu wurde die Translokation des Transktiptionsfaktors NFAT nach Expression von STIM1 bzw. STIM1A und die Auswirkungen einer Inhibition der PDE8B analysiert. In der Tat resultierte die Verwendung eines PDE8B-Blockers in einer verstärkten NFAT Translokation, die nach Expression von STIM1 gegenüber STIM1A-induzierter NFAT Translokation erhöht war. Dieser Effekt war unabhängig vom intrazellulären Ca2+.Obwohl eine erhöhte Interaktion von STIM1 und der PDE8B nicht mittels Immunpräzipitation nachgewiesen werden konnte, sprechen die Daten des funktionellen Assays stark dafür. Daten dieser Arbeit verdeutlichen den molekularen Mechanismus des alternativen Spleißens als einen potenten Mechanismus, um die Feinregulation von Proteinfunktion und -Lokalisierung Zelltyp-spezifisch anzupassen.