Charakterisierung und Funktion von TRPV2 Ionenkanälen in kortikalen Mikrogliazellen der Maus

Abstract

Transkriptomanalysen unter Verwendung FACS-sortierter kortikaler Mikrogliazellen der Maus haben ergeben, dass Transkripte des Ionenkanals Trpv2 im Vergleich zu anderen Ionenkanälen der TRP-Familie stark exprimiert werden. In meiner Masterarbeit hatte ich bereits mit der pharmakologischen Charakterisierung des Ca2+-permeablen nicht-selektiven TRPV2- Kationenkanals begonnen (Malihpour, 2017). In der vorliegenden Arbeit habe ich diese Charakterisierung fortgesetzt und die Rolle von TRPV2 in den Mikrogliazellen der Maus untersucht. Hierzu wurden Whole-Cell Patch Clamp und Ca2+ Imaging Experimente, sowie Migrations- und Phagozytoseversuche, auch unter Verwendung der Mikrogliamodellzelllinie BV2, durchgeführt. Ebenso wurde sowohl das murine als auch das humane TRPV2-Protein in HEK293- und COS-7-Zellen überexprimiert und pharmakologisch charakterisiert. Die TRPV2 Agonisten 2-APB und THC (Δ9-Tetrahydrocannabinol) induzieren sowohl in den Mikrogliazellen der Maus als auch in BV2-Zellen Membranströme, die unabhängig von der Aktivierung von Cannabinoidrezeptoren sind, durch TRPV2 Antagonisten (Ruthenium Rot, Valdecoxib und Tiloron) inhibiert werden und in Mikrogliazellen aus Trpv2-defizienten Mäusen nicht auftreten. Ein weiterer TRPV2-Agonist, Cannabidiol, induzierte weder in Mikrogliazellen der Maus noch in HEK293-Zellen, in denen murines TRPV2 überexprimiert wurde, einen messbaren Strom. Im Gegensatz dazu konnte durch Cannabidiol, THC und 2-APB sowohl in HEK293- als auch in COS-7-Zellen, in denen das humane TRPV2 Protein überexprimiert wurde, Ströme induziert werden, die durch Ruthenium Rot, Valdecoxib und Tiloron inhibiert wurden. Das Endocannabinoid 2-Arachidonoylglycerol (2-AG) führte nicht zu einer Aktivierung von TRPV2, induzierte aber TRPV2- und Cannabinoidrezeptor- unabhängige Ströme, die sowohl in den Mikrogliazellen als auch in den BV2-Zellen auftraten, nicht jedoch in HEK293-Zellen. Die Grundlage dieser Ströme muss noch untersucht werden. Mikrogliazellen können in vivo durch verschiedene Stimuli wie Traumata oder auch durch bakterielle Infektion aktiviert werden. Dabei ändern sie ihre Morphologie und Genexpression, wandern zum Ort des Geschehens, phagozytieren Zelltrümmer und Bakterien und produzieren reaktive Sauerstoffspezies (ROS). Um eine mögliche Beteiligung des TRPV2-Proteins an diesen Mikroglia-spezifischen Reaktionen nachzuweisen, habe ich das Migrationsverhalten, die Phagozytoseaktivität und die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies, in Ab- bzw. Anwesenheit verschiedener TRPV2 Agonisten und Antagonisten in primären Mikrogliazellen von Wildtyp und Trpv2-defizienten Mäusen, sowie in BV2-Zellen untersucht. 8 Zusammenfassung Zunächst habe ich, als Modell für eine bakterielle Infektion, Mikrogliazellen mit Lipopolysacchariden (LPS) stimuliert und das Migrationsverhalten analysiert. Dabei zeigte sich, dass nach Stimulation mit LPS das Migrationsverhalten sowohl von primären Mikrogliazellen aus dem Kortex der Maus als auch von BV2-Zellen im Vergleich zu nicht stimulierten Zellen erhöht ist. Dieser Effekt konnte in Mikrogliazellen, die aus Trpv2- defizienten Mäusen isoliert waren, nicht beobachtet werden, was darauf hinweist, dass TRPV2 eine Rolle bei der Migration der Mikrogliazellen einnimmt. In der vorliegenden Arbeit konnte außerdem gezeigt werden, dass die ROS-Produktion in in primären Mikrogliazellen und in BV2-Zellen nach einer 24-stündigen Inkubation mit LPS signifikant erhöht war und diese Erhöhung durch die TRPV2 Antagonisten Ruthenium Rot und Valdecoxib wieder reduziert werden konnte. Folglich ist das ein Hinweis darauf, dass die Produktion von ROS in Mikrogliazellen ebenfalls von der Aktivität des TRPV2-Proteins abhängt. Desweiteren war die Phagozytoserate der Mikrogliazellen nach Stimulation mit LPS in Trpv2-/- Zellen signifikant gegenüber dem Wildtyp reduziert. Ich konnte in der vorliegenden Arbeit mittels des pharmakologischen Profils und der Verwendung von Trpv2-defizienten Mäusen zeigen, dass murine Mikrogliazellen über funktionelle TRPV2 Kanäle verfügen, die an Mikroglia-spezifischen Funktionen wie Migration, Phagozytose und ROS-Produktion signifikant beteiligt sind. Somit könnte TRPV2 in Zukunft ein interessantes Zielmolekül darstellen, um bei pathologischen Ereignissen im zentralen Nervensystem die Aktivität und Funktion von Mikrogliazellen pharmakologisches zu regulieren.