'Lab in a Cell' developing yeast-based systems for rapid in vivo characterization of redox enzyme activity

Abstract

Classic in vitro characterization of thioredoxin superfamily proteins has severallimitations i.e., initial time-consuming purification of recombinant proteinsor the inactivity of some proteins in these assays. Therefore, the development of new methods is highly desirable. Here, assays utilizing genomically engineered yeast cells, expressing genetic fusion constructs between redox sensitive fluorescent proteins and thioredoxin superfamily members, were developed to monitor their enzymatic activity in vivo. Importantly, the oxidation kinetics of roGFP2 directly correlated with the in vitro-determined enzymatic activity of a range of thioredoxin-fold proteins and mutants thereof. These novel assays were applied as high-throughputscreens to assessglutaredoxin structure-functionrelationships and their catalytic mechanisms. This new methodology should accelerate future research intoredox protein mechanisms and function.

Der Thioredoxin-Superfamilie (TSF) gehört eine Vielzahl von Proteinen an. Davon sind einige noch kaum erforscht und es ist oftmals unklar ob sie redox-aktiv sind oder nicht. Meist werden diese Proteine in vitro charakterisiert. Zu den Limitationen dieser Methode gehören die zeitintensive Aufreinigung sowie darauffolgende Inaktivität einiger Proteine. Daher ist die Entwicklung neuer Methoden von großer Bedeutung. In dieser Arbeit wurden genetisch veränderte Hefezellen verwendet, die Fusionskonstrukte zwischen roGFP2 und TSF Proteinen exprimieren, um deren enzymatische Aktivität in vivo zu bestimmen. Dabei wurde herausgefunden, dass roGFP2-Oxidationskinetiken die Aktivität des fusionierten Proteins widerspiegeln und mit den in vitro-Daten korrelieren. Die neuartigen Methoden erlauben dabei ein Hochdurchsatz-Screening, welches genutzt wurde, um Fragen hinsichtlich der Struktur-Funktions-Beziehungen und katalytischer Mechanismen von Glutaredoxinen zu adressieren. Dies ermöglichte (i.) die Identifikation der wichtigsten strukturellen Unterschiede zwischen redox-aktiven und -inaktiven Glutaredoxinen. (ii.) Entgegen bestehender Modelle konnte demonstriert werden, dass Disulfide in endogenen Proteinen durch monothiole Glutaredoxine reduziert werden können. (iii.) Weiter wurde gezeigt, dass Glutaredoxine die GSNO-abhängige Oxidation von roGFP2 in vivo katalysieren. Diese neue Methodik wird die zukünftige Erforschung der Mechanismen und Funktion von Redox-Proteinen beschleunigen.