Toxicometabolomics of cathinone derivatives

Abstract

Die vorliegende Arbeit untersuchte den Metabolismus der synthetischen Cathinone alpha-PBP, alpha-PVT, alpha-PHP, alpha-PEP, and alpha-POP mit und ohne Metabolomik. Der Metabolismus wurde konventionell untersucht, sowie die Kinetikparameter der beteiligten Cytochrom P450 (CYP) Enzyme bestimmt. Ein ungerichtetes Metabolomik (UM)-Arbeitsschema wurde entwickelt, optimiert und auf Inkubationen mit gepoolten humanen Lebermikrosomen (pHLM), sowie HepaRG Zellen angewandt. Alle untersuchten Cathinone wurden reduziert, bildeten Laktame und wurden an ihren Pyrrolidinringen hydroxyliert. Hauptsächlich am Metabolismus beteiligt waren die polymorph exprimierten CYP2D6, CYP2C9 und CYP2C19. Die Entwicklung des UM Arbeitsschema zeigte, dass die Parameter der Präprozessierung und die Auflösung des Massen- spektrometers wichtig für die Wiederfindung von Analyten sind. Angewandt auf pHLM stellte sich UM als effektiver im Vergleich zu konventionellen Methoden heraus, wobei die Ergebnisse vergleichbar mit primären humanen Hepatozyten waren. Die Untersuchung verschiedener Rekonstitutionsmittelmischungen zeigte, dass eine Zusammensetzung von 30% Methanol und 70% Acetonitril gut geeignet ist, um hohe Feature-Flächen und Gesamtfeaturezahlen zu erhalten. Die Anwendung von UM auf Inkubationen mit HepaRG Zellen führte zur Detektion von unerwarteten Aminosäure-Addukten. Diese Addukte wurden bisher noch nicht in der Literatur beschrieben und können wahrscheinlich auch im Menschen detektiert werden.

The presented work investigated the metabolism of the synthetic cathinones alpha-PBP, alpha-PVT, alpha-PHP, alpha-PEP, and alpha-POP with and without metabolomics techniques. The metabolism was elucidated using conventional methods and the kinetic parameters of the involved cytochrome P450 (CYP) enzymes were determined. An untargeted metabolomics (UM) workflow was developed, optimized, and applied to incubations using pooled human liver microsomes (pHLM) and HepaRG cells. All investigated cathinones underwent reduction of the cathinone oxo group, lactam formation and hydroxylation of the pyrrolidine ring. The CYP enzymes involved in the metabolism were polymorphically expressed including CYP2D6, CYP2C9, and CYP2C19. Development of the UM workflow revealed the preprocessing parameters and the resolution of the mass spectrometer as vital parameters effecting the recovery of analytes. The metabolomics approach using pHLM appeared to be more effective than the conventional approach, detecting almost as much metabolites as primary human hepatocytes. The investigation of different reconstitution solvent mixtures showed that a composition of 30% methanol and 70% acetonitrile was well suited to obtain high feature areas and total feature counts. Applying UM to incubations using HepaRG cells led to the detection of unexpected amino acid adducts with the investigated cathinones. These adducts were not described in previous publications and are likely detectable in humans, as well.