Die Effekte des Extrazellulären Adhärenzproteins auf Zellen nicht-muskelinvasiver Urothelkarzinome der Harnblase

Abstract

Das von Staphylococcus aureus sezernierte Extrazelluläre Adhärenzprotein (Eap) zeichnet sich durch diverse Wirkungen auf die Proliferation, Migration, Adhäsion sowie Zellmorphologie und Differenzierung verschiedener humaner Zelltypen aus. In der jüngsten Forschung unseres Institutes konnte auch ein inhibitorischer Einfluss auf das Zellwachstum neoplastischer Zellen nachgewiesen werden. Auf der Basis dieser Erkenntnisse wurden in dieser Arbeit die Auswirkungen von einer kurzzeitigen Inkubation mit Eap an Zelllinien nicht-muskelinvasiver Karzinome der Harnblase (NMIBC), welches den zehnthäufigsten Tumortyp weltweit darstellt, untersucht. NMIBC zeichnen sich durch sehr heterogene Erkrankungsverläufe aus, wobei eine der häufigsten Komplikationen das Auftreten eines Rezidivs trotz einer durchgeführten Standardtherapie, welche aus einer transurethralen Resektion des Tumors mit anschließender Spülung der Blase mit einem Therapeutikum besteht, darstellt. Für die durchgeführten Untersuchungen wurde diese Therapie zu einem in vitro Instillationsmodell modifiziert. Es konnte gezeigt werden, dass von den untersuchten vier Zelllinien nur die Zelllinie RT-112 24 Stunden nach einer zweistündigen in vitro Instillationstherapie mit Eap eine signifikant geringere Proliferation als die Kontrolle aufwies. Bei der Betrachtung der Stoffwechselaktivität der Zellen fiel nach der Therapie mit Eap bei den Zelllinien RT-112 und 5637 lediglich der statistische Trend auf, dass diese weniger aktiv waren als die unbehandelte Kontrolle. Auch vier Tage nach der einmaligen Behandlung mit 40 µg/ml Eap konnte für diese beiden Zelllinien weiterhin ein statistischer Trend registriert werden, der auf eine verringerte Proliferationsrate im Vergleich zu der Kontrolle hinwies. Zusätzlich wurden als einfaches dreidimensionales Tumor-Modell Sphäroide unter Einfluss von Eap beobachtet. Hier konnte im besonderen Maße eine Beeinflussung der Sphäroidbildung von mit 40 µg/ml vorbehandelten RT-112-Zellen beobachtet werden, die im Vergleich zu den Kontroll-Sphäroiden über den gesamten Versuchszeitraum signifikant kleiner waren. Da aber bei keiner Zelllinie innerhalb des Sphäroidverbandes nach einer Eap-Therapie ein von der Kontrollsituation im relevanten Maße abweichender Adenosintriphosphat-Gehalt beobachtet wurde, kann vermutet werden, dass Eap vermutlich mehr die Zellaggregation der RT-112-Sphäroide und weniger deren Stoffwechselaktivität beeinflusst. Die Sphäroide der drei weiteren hier untersuchten Zelllinien schienen in ihrer Bildung, ihrem Wachstumsverlauf und ihrer Stoffwechselaktivität hingegen weitestgehend unbeeinflusst von Eap zu sein. Um einen potenziellen Effekt von Eap auf die Rezidivbildung von NMIBC zu untersuchen, wurden bereits angewachsene Sphäroide nach einer Inkubation mit aufsteigenden Eap-Konzentrationen auf eine die Blasenwand simulierende Flachbodenwellplatte ausgesät. In Hinblick auf das Grading der Tumore inhibierte Eap in diesem Assay die als G1-eingestufte Zelllinie RT-4 am geringsten und zeigte auf den als G3-Tumor klassifizierten UMUC-3-Sphäroid den stärksten inhibitorischen Einfluss auf das Auswachsen der Zellen. Die von G2-Tumoren entstammenden Zelllinien RT-112 und 5637 gebildeten Sphäroide waren nach einer zweistündigen Eap-Vorbehandlung ebenfalls signifikant in Ihrer Ausbreitungsfähigkeit reduziert. Die Beobachtung, dass Eap drei der vier verwendeten Zelllinien in ihrem Auswachsen hemmt, deutet auf eine Beeinflussung von Eap auf das Wachstum von NMIBC und deren Rezidivbildung hin. In Anbetracht des schon bekannten hemmenden Einflusses von Eap auf die Neovaskularisierung und der im Rahmen dieser Arbeit gezeigten Effekte könnte das bakterielle Protein ein vielversprechendes neues Therapeutikum im Rahmen einer Instillationstherapie von NMIBC darstellen.

The extracellular adherence protein (Eap) secreted by Staphylococcus aureus is known for its diverse inhibitory effects on proliferation, migration, adherence and differentiation of various eukaryotic cell types. Recent findings of our Institute demonstrated furthermore that Eap also exerts some inhibitory effects on neoplastic cells. Based on these findings, the impact of a short-term Eap incubation on cell lines derived from non-muscle-invasive bladder cancer (NMIBC), which is the tenth most frequent tumor worldwide, was investigated. NMIBC are characterized by very heterogeneous disease histories, whereby one of the most common complications is a recurrence of the tumor despite of the fact that the patient was treated by the standard therapy, which includes a transurethral resection of the tumor followed by a drug-instillation of the bladder. In order to mimic this scenario, an in vitro instillation model was developed and tested with Eap and four different NMIBC-derived cell lines. When 2D-cell cultures of the NMIBC cell lines were challenged with Eap for a duration of two hours, significant reductions of the proliferation rates were observed for just one (RT-112) out of the four tested cell lines at 24 hours post treatment compared with the control. Moreover, a statistical trend concerning a reduction of metabolic activity after the in vitro instillation with Eap compared to the control was examined for the cell lines RT-112 and 5637. However, at four days post Eap treatment, this statistical trend could still be shown for these two cell lines, which indicated a reduced rate of proliferation compared to the control. To mimic the in vivo growth characteristics of tumors more closely, the impact of Eap on spheroid formation and outgrowth was studied next. In this assay format, the two hours in vitro instillation therapy with Eap significantly decreased the spheroid formation of the cell line RT112, while the other three NMIBC cell lines tested here were not markedly affected by this bacterial protein. Regarding the adenosin triphosphat-concentrations of spheroids revealed no clear differences between Eap-challenged and control spheroids for all cell lines, suggesting that Eap probably affects the cell aggregation of RT-112-spheroids rather than the metabolic activity of the spheroids of this cell line. To study the impact of Eap on the recurrence of the tumor, the instillation therapy was next applied in combination with an outgrow model, in which preformed spheroids were challenged for two hours with Eap and subsequently placed on a flat-bottom well plate to stimulate outgrowth. When related to the grading of the tumor cell lines, the weakest effect of Eap was observed for the G1-classified cell line RT-4 in this assay, while the strongest inhibitory influence on the outgrow was found for the G3-classified tumor UMUC-3 spheroid. The G2-classified tumor cell lines RT-112 and 5637 also displayed marked decreases in outgrow of cells after Eap treatment. The fact that Eap significantly reduced the area covered by cells for three out of four cell lines, suggesting that Eap is likely to affect the recurrence of tumor tissue. Together with its previously demonstrated inhibitory capacity on neovascularization, the findings presented here suggest that Eap might represent a potential agent for a transurethral instillation therapy for NMIBCs.