Impact of Mitochondrial Genetic Variants in ND1, ND2, ND5 and ND6 Genes on Sperm Motility and Intracytoplasmic Sperm Injection (ICSI) Outcomes

Abstract

Sperm mitochondrial dysfunction generates an insufficient amount of the energy that required for the movement of sperm flagellum. In this case, sperm cannot reach the site of fertilization, thereby reducing sperm fertilization capacity, and thus usually causing most asthenozoospermic men to need assisted reproductive techniques. The etiology of asthenozoospermia itself remains largely unknown. The aim of this current study is therefore to investigate the effect of mitochondrial genetic variants on sperm motility and intracytoplasmic sperm injection (ICSI) outcomes. Furthermore, this study aims to investigate the role of oxidative stress in mitochondrial dysfunction by measuring the protein carbonyl levels in the sperm of asthenozoospermic men. A total of 150 couples from the ICSI cycle were enrolled in this study. One hundred-and-five of the male partners were asthenozoospermic patients, and they were subdivided into three groups, according to their percentage of sperm motility, while forty-five of the male partners were normozoospermic. Genetic variants were screened using direct Sanger’s sequencing in four mitochondrial genes Nicotinamide adenine dinucleotide hydrogen (NADH) dehydrogenase 6 (ND6), NADH dehydrogenase 5 (ND5), NADH dehydrogenase 2 (ND2) and NADH dehydrogenase 1 (ND1) in the sperm of the male partners. Protein carbonyl was used as a biomarker to detect protein oxidative damage, a phenomenon which is induced by the attacks of reactive nitrogen species (RNS) in addition to reactive oxygen species (ROS). Furthermore, protein degradation causing the formation of carbonyl groups, which is derived from the direct oxidation process of a number of amino-acids’ side chains such as threonine and arginine residues. Quantitation of the protein carbonyl levels in the sperm of asthenozoospermic men was performed using the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique. Sperm motility was significantly positively correlated with the fertilization rate (r=0.701, p<0.001). The medians of the fertilization rate among groups (G) were: (G1 (36±1.86), G2 (40±1.63), G3 (47±13.41) and the control (67±14.69) p< 0.001). Sperm motility was also significantly positively correlated with the embryo cleavage score (r=0.549, p<0.001). The medians of the embryo cleavage score among the groups were: (G1 (3±0.31), G2 (3.34±0.36), G3 (3.58±0.31) and the control (3.66±0.25) p< 0.001). Furthermore, sperm motility was significantly positively correlated with the embryo quality score (r=0.656, p<0.001). The medians of the embryo quality score among the groups were: (G1 (1.5±0.31), G2 (1.75±0.39), G3 (2.14±0.44) and the control (2.5±0.27) p< 0.001). On the other hand, the fertilization rate was significantly positively correlated with the embryo cleavage score (r=0.590, p<0.001) and with the embryo quality score (r=0.745, p<0.001). The protein carbonyl levels were significantly negatively correlated with the sperm motility (r=-0.894, P<0.001). The medians of the protein carbonyl levels among the groups were: (G1 (2.24±0.3), G2 (1.97±0.17), G3 (1.22±0.2) and the control (0.32±0.12) p< 0.001). The protein carbonyl levels were negatively correlated with the fertilization rate (r = - 0.670, P <0.001), the embryo cleavage score (r = - 0.511, P <0.001) and the embryo quality score (r = - 0.623, P <0.001). The frequency of the total variants in all genes was negatively correlated with the percentage of sperm motility, P <0.001.Three significant variants were identified, namely: 13708 G>A (rs28359178) in ND5, 4216 T>C (rs1599988) in ND1 and a novel 12506T>A in ND5 with P-values: 0.006, 0.036 and 0.013, respectively. The medians of the sperm motility, the fertilization rate, the embryo quality score and the embryo cleavage score were significantly differed between men showing 4216 T>C, 12506T>A, 13708G>A and the wild type, Mann-Whitney P-values for the differences in the medians were < 0.05 in all of them. In conclusion, the sperm motility was positively correlated with the ICSI outcomes, while protein carbonyl levels were negatively correlated with sperm motility and ICSI outcomes. This demonstrates that sperm motility can predict the ICSI outcomes, and the quantification of protein carbonyl can be used as a biomarker for protein oxidative damage in sperm. The frequencies of total mitochondrial variants in ND1, ND2, ND5 and ND6 genes were negatively correlated with the percentages of sperm motility and the ICSI outcomes. Finally, the results from this study showed three missense variants, namely, 13708 G>A, 4216 T>C and 12506T>A, which were found to be negatively correlated with sperm motility and ICSI outcomes.

Die mitochondriale Dysfunktion von Spermien erzeugt eine unzureichende Menge an Energie, die für die Bewegung der Spermiengeißel erforderlich ist. In diesem Fall können die Spermien den Ort der Befruchtung nicht erreichen, wodurch die Befruchtungsfähigkeit der Spermien reduziert wird und somit die meisten asthenozoospermischen Männer in der Regel assistierte Reproduktionstechniken benötigen. Die Ätiologie der Asthenozoospermie selbst ist noch weitgehend unbekannt. Das Ziel dieser aktuellen Studie ist es daher, den Einfluss mitochondrialer genetischer Varianten auf die Spermienmotilität und die Ergebnisse der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) zu untersuchen. Darüber hinaus soll in dieser Studie die Rolle von oxidativem Stress bei der mitochondrialen Dysfunktion untersucht werden, indem der Protein-Carbonyl-Gehalt in den Spermien von asthenozoospermischen Männern gemessen wird. Insgesamt wurden 150 Paare aus dem ICSI-Zyklus in diese Studie eingeschlossen. Einhundertfünfundfünfzig der männlichen Partner waren asthenozoospermische Patienten, und sie wurden in drei Gruppen unterteilt, je nach dem Prozentsatz ihrer Spermienmotilität, während fünfundvierzig der männlichen Partner normozoospermisch waren. Genetische Varianten wurden mittels direkter Sanger-Sequenzierung in vier mitochondrialen Genen Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Hydrogenase 6 (ND6), NADH-Dehydrogenase 5 (ND5), NADH-Dehydrogenase 2 (ND2) und NADH-Dehydrogenase 1 (ND1) im Sperma der männlichen Partner untersucht. Protein-Carbonyl wurde als Biomarker verwendet, um oxidative Schäden an Proteinen nachzuweisen, ein Phänomen, das durch den Angriff reaktiver Stickstoffspezies (RNS) zusätzlich zu den reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) induziert wird. Darüber hinaus verursacht der Proteinabbau die Bildung von Carbonylgruppen, die aus dem direkten Oxidationsprozess einer Reihe von Seitenketten von Aminosäuren wie Threonin- und Argininresten stammen. Die Quantifizierung der Protein-Carbonyl-Gehalte in den Spermien asthenozoospermischer Männer wurde mit der Enzymimmunoassay (ELISA)-Technik durchgeführt. Die Spermienmotilität war signifikant positiv mit der Befruchtungsrate korreliert (r=0,701, p<0,001). Die Mediane der Befruchtungsrate zwischen den Gruppen (G) waren: (G1 (36±1.86), G2 (40±1.63), G3 (47±13.41) und die Kontrolle (67±14.69) p< 0.001). Die Spermienmotilität war auch signifikant positiv mit dem Embryo-Cleavage-Score korreliert (r=0,549, p<0,001). Die Mediane des Embryo-Cleavage-Scores zwischen den Gruppen waren: (G1 (3±0,31), G2 (3,34±0,36), G3 (3,58±0,31) und die Kontrolle (3,66±0,25) p<0,001). Außerdem war die Spermienmotilität signifikant positiv mit dem Embryoqualitätsscore korreliert (r=0,656, p<0,001). Die Mediane des Embryoqualitätsscores zwischen den Gruppen waren: (G1 (1,5±0,31), G2 (1,75±0,39), G3 (2,14±0,44) und die Kontrolle (2,5±0,27) p<0,001). Andererseits war die Befruchtungsrate signifikant positiv korreliert mit dem Embryo-Cleavage-Score (r=0,590, p<0,001) und mit dem Embryo-Quality-Score (r=0,745, p<0,001). Die Protein-Carbonyl-Werte waren signifikant negativ mit der Spermienmotilität korreliert (r=-0,894, p<0,001). Die Mediane der Protein-Carbonyl-Werte zwischen den Gruppen waren: (G1 (2,24±0,3), G2 (1,97±0,17), G3 (1,22±0,2) und die Kontrolle (0,32±0,12) p<0,001). Die Protein-Carbonyl-Gehalte waren negativ korreliert mit der Befruchtungsrate (r = - 0,670, p <0,001), dem Embryo-Cleavage-Score (r = - 0,511, p <0,001) und dem Embryo-Quality-Score (r = - 0,623, p <0,001). Die Häufigkeit der Gesamtvarianten in allen Genen war negativ mit dem Prozentsatz der Spermienmotilität korreliert, P <0,001.Drei signifikante Varianten wurden identifiziert, nämlich: 13708 G>A (rs28359178) in ND5, 4216 T>C (rs1599988) in ND1 und eine neue 12506T>A in ND5 mit P-Werten: 0,006, 0,036 und 0,013, jeweils. Die Mediane der Spermienmotilität, der Befruchtungsrate, des Embryo-Qualitäts-Scores und des Embryo-Cleavage-Scores unterschieden sich signifikant zwischen Männern mit 4216 T>C, 12506T>A, 13708G>A und dem Wildtyp, Mann-Whitney P-Werte für die Unterschiede in den Medianen waren in allen Fällen < 0,05. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Spermienmotilität negativ mit den ICSI-Ergebnissen korreliert war. Die Protein-Carbonyl-Werte waren ebenfalls negativ mit der Spermienmotilität und den ICSI-Ergebnissen korreliert. Dies zeigt, dass die Spermienmotilität die ICSI-Ergebnisse vorhersagen kann, und die Quantifizierung von Protein-Carbonyl kann als Biomarker für oxidative Proteinschäden in Spermien verwendet werden. Die Häufigkeiten der gesamten mitochondrialen Varianten in den Genen ND1, ND2, ND5 und ND6 waren negativ mit den Prozentsätzen der Spermienmotilität und den ICSI-Ergebnissen korreliert. Schließlich zeigten die Ergebnisse dieser Studie drei Missense-Varianten, nämlich 13708 G>A, 4216 T>C und 12506T>A, die negativ mit der Spermienmotilität und den ICSI-Ergebnissen korreliert waren.