Funktionelle Charakterisierung von CEP290-assoziierten Ziliopathien

Abstract

Primäre Zilien sind konservierte Zellorganellen und in die Regulation zahlreicher Signalwege involviert, welche essentiell für die Entwicklung und die Aufrechterhaltung der Zellhomöostase sind. Daher präsentieren sich genetisch bedingte ziliäre Dysfunktionen klinisch in Form mannigfaltiger Syndrom-Komplexe, welche unter dem Begriff der Ziliopathien subsumiert werden. Bei der Pathogenese dieser heterogenen Erkrankungsgruppe nimmt das Transitions-Zonen-Protein CEP290 als wichtiger Bestandteil der ziliären Diffusionsbarriere eine Schlüsselrolle ein. Es wurden bereits zahlreiche Mutationen in CEP290 mit diversen Ziliopathien in Verbindung gebracht. Wie die unterschiedlichen Mutationen jedoch zu den jeweiligen Symptomen führen, ist weitestgehend unbekannt. Das Ziel dieser Arbeit war es genauere Erkenntnisse der molekularen Funktion von CEP290 als Komponente der ziliären Barriere zu gewinnen. Hierzu wurde eine heterogene Gruppe von vier ziliär dysfunktionalen CEP290-Mutanten generiert und validiert, welche mit den Ziliopathien Cerebellooculorenal syndrome/Senior-Loken-Syndrom (CORS/SLS), Bardet-Biedl-Syndrom (BBS), Joubert-Syndrom (JS) als auch der Leberschen kongenitalen Amaurose (LCA) assoziiert werden. Ferner wurde eine zum Vergleich dienende wildtypische CEP290-Variante exprimierende Zelllinie erzeugt. Die Charakterisierung der Zelllinien offenbarte neben signifikant eingeschränkten Wachstumsraten anscheinend deutlich divergierende Stabilitäten der unterschiedlichen CEP290-Varianten. Zudem konnte eine zumindest partielle Fehllokalisation der CEP290-Variante in der CORS/SLS-Modell-Zelllinie sowie ein höchstwahrscheinlich auf eine vorzeitige Degradation zurückzuführendes vollständiges Fehlen der CEP290-Variante in der LCA-Modell-Zelllinie aufgedeckt werden. Analysen der ziliären Proteinkomposition der CEP290-Zelllinien deuten auf eine unterschiedlich starke Dysfunktion der ziliären Barriere hin, was insbesondere durch deutlich reduzierte Level von Arl13b sichtbar wurde. Die beobachtete Einschränkung der Ziliogenese in Form von verkürzten Zilien ist daher vermutlich hauptsächlich auf eine Fehlregulation durch das als Schlüsselspieler an der Ziliogenese beteiligte Arl13b zurückzuführen. Außerdem konnte ermittelt werden, dass der intraflagelläre Transport (IFT) von Proteinen in der JS-Modell-Zelllinie aufgrund erhöhter Ift88-Level erheblich stärker gestört sein könnte als in der BBS-Modell-Zelllinie und sich so ein erster Hinweis darauf ergibt, warum sich die beiden Ziliopathien trotz einer ähnlichen Verkürzung von CEP290 klinisch so divers präsentieren. Dahingegen scheint der unter anderem in die Ziliogenese involvierte CEP290-Interaktionspartner Pcm-1 zumindest in seiner subzellulären Verteilung nur in der JS-Modell-Zelllinie betroffen zu sein. Abschließend konnte eine essentielle Rolle von CEP290 in der Barrierefunktion der Transitions-Zone verifiziert und wichtige Hinweise zu den molekularen Ursachen der immensen Variabilität der Erkrankungsgruppe gewonnen werden.

Primary cilia are conserved cell organelles and involved in the regulation of numerous pathways that are essential for the development and maintenance of cell homeostasis. Thus, genetically-based ciliary dysfunctions are presented clinically as diverse syndrom complexes, which are referred to as ciliopathies. CEP290 plays a key role in the pathogenesis of this heterogenous group of diseases and is an integral component of the so-called transition zone that forms the ciliary diffusion barrier and thereby separates the cilium from the rest of the cell. Interestingly, many different mutations in CEP290 have been associated with various ciliopathies, yet how these mutations in CEP290 lead to the diverse symptoms remains unclear. The aim of this thesis was to gain insights into the molecular function of CEP290 as a central component of the ciliary barrier. To this end a heterogenic group of four ciliary dysfunctional CEP290 mutants could successfully be generated and validated, which are associated with the ciliopathies Cerebellooculorenal syndrome/Senior Loken syndrome (CORS/SLS), Bardet-Biedl syndrome (BBS), Joubert syndrome (JS) and Leber congenital amaurosis (LCA). In addition, a wild type CEP290 variant expressing cell line for comparison was made. The subsequent characterisation of the cell lines revealed significantly reduced growth rates next to apparently diverging stabilities of the different CEP290 variants. Moreover, at least a mislocalisation of the CEP290 variant could be detected in the CORS/SLS model cell line besides a complete absence of the CEP290 variant in the LCA model cell line, most likely due to instability and degradation. Analyses of the ciliary protein composition of the CEP290 cell lines showed different degrees of dysfunction of the ciliary barrier, exemplified by significantly reduced levels of the key ciliogenesis factor Arl13b. Therefore the apparent reduction in ciliogenesis as observed by reduced ciliary lengths is presumably based on a defective regulation of Arl13b. It could also be determined that intraflagellar transport (IFT) of proteins is probably more severely affected in the JS model cell line compared to the BBS model cell line due to elevated Ift88 levels. This finding gives a first clue for the clinical diversity of both ciliopathies despite of a similar truncation of CEP290 in the two models. Furthermore, the subcellular distribution of the CEP290 interaction partner Pcm-1, which is involved in the process of ciliogenesis, seems to be specifically affected in the JS model cell line. In conclusion, the presented results verify an essential role of CEP290 in the barrier function of the transition zone and provide important hints towards our understanding of the molecular pathogenesis and the immense variability of this group of diseases.