Bitte benutzen Sie diese Referenz, um auf diese Ressource zu verweisen: doi:10.22028/D291-34165
Titel: Different domains of Complexin II regulate tonic secretion and Synaptotagmin-mediated synchronous transmitter release
VerfasserIn: Makke, Mazen
Sprache: Englisch
Erscheinungsjahr: 2020
Erscheinungsort: Homburg/Saar
Kontrollierte Schlagwörter: Exocytose
Vesikel
Proteine
DDC-Sachgruppe: 610 Medizin, Gesundheit
Dokumenttyp: Dissertation
Abstract: Exocytosis of transmitter-storing vesicles requires specialized proteins known as SNARE proteins (Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein Attachment Receptor), which comprise the vesicular membrane-associated (v-SNARE) Synaptobrevin and the two cytoplasmic membrane-associated target SNARE proteins (t-SNAREs), Syntaxin and SNAP25. The assembly of membrane-bridging SNAREs provides the force for overcoming the energy barriers of vesicle fusion. To avoid unregulated fusion, SNARE complex activity requires tight control by the auxiliary proteins, like complexin (Cpx) and synaptotagmin (Syt), but their precise mode of action remained enigmatic. The experimental work in this doctoral thesis was designed to provide new insight into the mode of Cpx action in Ca2+-triggered exocytosis. For this, chromaffin cells were used as a model system and defined mutants of CpxII were expressed in CpxII ko cells to study its impact in a gain-of-function approach. The results show that the carboxyl-terminal domain (CTD) of CpxII hinders premature fusion of vesicles, thereby augmenting the pool of primed vesicles. Biochemical experiments indicate that the CpxII CTD interacts with t-SNARE proteins and slows SNARE complex formation. Sequence alignments pinpoint a high degree of similarity between the amphipathic region of the CpxII CTD and the SNARE motif SNAP25 SN1. Indeed, chimera proteins between CpxII and SNAP25 show that the corresponding SNAP25 SN1 domain fully restores the inhibitory function of CpxII. These results support a model wherein the amphipathic region of CpxII CTD competes with the SNAP25-SN1 domain for binding to the SNARE complex. Collectively, they provide new insight into the postulated molecular ‘clamp’, which arrests prefusion intermediates awaiting the Ca2+-trigger. The N-terminal domain (NTD) of CpxII, instead, was found to increase the rate of Ca2+-triggered synchronized fusion, indicating that CpxII provides two independent functions that synergize in increasing synchronous fusion. Truncation of the CpxII NTD (CpxII DN) decelerated synchronous fusion in wild type and Syt7-deficient chromaffin cells, but not Syt1 knock-out cells, suggesting that CpxII cooperates with Syt1. In knock-ins of Syt1 with reduced Ca2+ affinity (R233Q), CpxII expression accelerated whereas CpxII DN expression decelerated the stimulus-secretion coupling, indicating that CpxII modulates Syt1 function in an NTD-dependent fashion. The second part of the thesis addresses the important question of whether the SybII TMD serves simply as a passive membrane anchor or plays an active role in catalyzing membrane fusion. The latter hypothesis bases on the observation that v-SNARE TMDs are characterized by their high content of ß-branched amino acids, like valine and isoleucine residues, which promote structural flexibility to the TMD helix. The results show that substituting the core residues of the SybII TMD with a stretch of rigidifying leucine hinders the fusion process leading to an accumulation of fusion-incompetent vesicles underneath the plasma membrane. Conversely, reintroducing flexibility to the SybII TMD with isoleucine residues reinstates the fusogenicity of the secretory vesicles. Thus, the flexibility of SybII’s TMD is required for facilitating the fusion process, suggesting that SNARE TMDs do not simply serve as passive membrane anchors, but play an active role in Ca2+-triggered secretion, most likely by reducing the energy barrier for fusion between opposing membranes. Overall, the results provide new insight into the well-orchestrated secretion machinery by elucidating CpxII’s action in regulating fusion, its interplay with the main Ca2+-sensor Syt1, and the contribution of SybII TMD in Ca2+-triggered exocytosis.
Die Exozytose transmitterspeichernder Vesikel erfordert spezialisierte Proteine, die als SNARE-Proteine (Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein Attachment Receptor) bekannt sind. Letztere umfassen das vesikulär-membranassoziierte (v-SNARE) Synaptobrevin und die beiden zytoplasmatischen-membranassoziierten SNARE-Zielproteine (t-SNAREs), Syntaxin und SNAP25. Die Assemblierung membranüberbrückender SNAREs liefert die Kraft zur Überwindung der Energiebarrieren während. Um eine unregulierte Fusion zu vermeiden, erfordert die SNARE-Komplexbildung eine strenge Kontrolle durch Hilfsproteine, wie z. B. Complexin (Cpx) und Synaptotagmin (Syt), deren genaue Wirkmechanismen jedoch unklar sind. Die experimentellen Arbeiten in dieser Doktorarbeit sollen neue Einsichten in die Wirkungsweise von Cpx bei der Ca2+-getriggerter Exozytose liefern. Dazu wurden Chromaffinzellen als Modellsystem verwendet und definierte Mutanten von CpxII in CpxII ko-Zellen exprimiert, um die Wirkung von CpxII in einem ‚gain-of-function‘-Ansatz zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen, dass die carboxyterminale Domäne (CTD) von CpxII eine vorzeitige Fusion der Vesikel verhindert und dadurch den Pool der fusionsbereiten Vesikel vergrößert. Biochemische Experimente weisen darauf hin, dass die CpxII-CTD mit t-SNARE-Proteinen interagiert und die Bildung von SNARE-Komplexen verlangsamt. Sequenzvergleiche offenbaren eine starke Ähnlichkeit zwischen der amphipathischen Region des CpxII CTD und dem SNARE-Motiv SNAP25 SN1. Praktisch zeigen Chimärenproteine zwischen CpxII und SNAP25, dass die entsprechende SNAP25 SN1-Domäne die inhibitorische Funktion von CpxII wieder vollständig herstellt. Diese Ergebnisse unterstützen ein Modell, in dem die amphipathische Region von CpxII CTD mit der SNAP25-SN1-Domäne um die Bindung an SNARE-Komplexe konkurriert. Zusammengefasst liefern sie neue Erkenntnisse zur postulierten molekularen "Klammer", die Präfusionszwischenprodukte vor dem eigentlichen Ca2+-Stimulus arretiert. Die N-terminale Domäne (NTD) von CpxII hingegen erhöht die Rate der Ca2+-getriggerten synchronen Fusion, was zeigt, dass CpxII zwei unabhängige Funktionen ausübt, die bei der Erhöhung der synchronen Fusion synergistisch zusammenwirken. Die Verlust der CpxII NTD (CpxII DN) verzögert die synchrone Fusion in Wildtyp- und Syt7-defizienten Chromaffinzellen, nicht aber in Syt1 knock-out-Zellen, was darauf hindeutet, dass CpxII mit Syt1 kooperiert. In Knock-in Varianten von Syt1 mit reduzierter Ca2+-Affinität (R233Q) wird die Reiz-Sekretions-Kopplung durch Expression von CpxII beschleunigt und durch Expression von CpxII DN verlangsamt. Diese Befunde zeigen, dass CpxII die Funktion von Syt1 in einer NTD-abhängigen Weise moduliert.Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der wesentlichen Frage, ob die SybII TMD lediglich als passiver Membrananker dient oder eine aktive Rolle bei der Katalyse der Membranfusion spielt. Letztere Hypothese basiert auf der Beobachtung, dass v-SNARE TMDs durch eine Überrepräsentation von ß-verzweigten Aminosäuren, wie Valin- und Isoleucin, charakterisiert werden Eigenschaft, die strukturelle Flexibilität der TMD-Helix fördert. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Substitution der Kernreste der SybII-TMD durch eine gleichlange Poly-Leucin Region den Fusionsprozess behindert, was zu einer Anhäufung von fusionskompetenten Vesikeln an der Plasmamembran führt. Umgekehrt kann durch Wiedereinführung flexibler Poly-Isoleucin-Reste in die SybII TMD die Fusogenität der sekretorischen Vesikel wiederhergestellt werden. Somit lässt sich schlussfolgern, dass die Flexibilität der SybII-TMD den Fusionsprozess erleichtert. Offensichtlich dienen SNARE-TMDs nicht nur als passiver Membrananker, sondern spielen darüber hinaus eine aktive Rolle bei der Ca2+-getriggerten Sekretion. Möglicherweise erzeugt die strukturelle Flexibilität der SybII TMD lokale Membranperturbationen und verringert somit die Energiebarriere für die Fusion gegenüberliegender Membranen. Insgesamt liefern die Ergebnisse neue Einblicke in die erstaunlich organisierte Sekretionsmaschinerie, indem sie die Wirkung von CpxII bei der Regulierung der Fusion, sein Zusammenspiel mit dem Ca2+-Hauptsensor Syt1 und den Beitrag von SybII TMD bei der Ca2+-getriggerten Exozytose veranschaulichen.
Link zu diesem Datensatz: urn:nbn:de:bsz:291--ds-341656
hdl:20.500.11880/31598
http://dx.doi.org/10.22028/D291-34165
Erstgutachter: Bruns, Dieter
Tag der mündlichen Prüfung: 1-Mär-2021
Datum des Eintrags: 2-Aug-2021
Fakultät: M - Medizinische Fakultät
Fachrichtung: M - Physiologie
Professur: M - Prof. Dr. Dieter Bruns
Sammlung:SciDok - Der Wissenschaftsserver der Universität des Saarlandes



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