Untersuchung der differenziellen Gen- und Proteinexpression humaner kornealer Fibroblasten aus gesunden und Keratokonus-Hornhäuten vor und nach Riboflavin-UV-A-Bestrahlung

Abstract

Fragestellung: Das Crosslinking (CXL) stellt eine minimal-invasive Therapiemöglichkeit dar, um die Progression des Keratokonus (KC) zu verlangsamen. Durch den simultanen Einsatz von Riboflavin als Photosensibilisator und einer UV-A-Bestrahlung entsteht oxidativer Stress, wodurch die Kollagenfibrillen im kornealen Stroma quervernetzt werden. Ziel dieser Arbeit war es, Expressionsveränderungen bei humanen kornealen Fibroblasten (HCF) und Keratokonus-HCF (KC-HCF) vor und nach einer Riboflavin-UV-A-Bestrahlung aufzuzeigen. Hierbei wurden Expressionsauswirkungen der inflammatorischen Marker Nukleärer Transkriptionsfaktor kappa B p65 (NFkB), induzierbare NO-Synthase (iNOS) und Interleukin-6 (IL-6) untersucht. Auch die Expression der im kornealen Stroma vorkommenden Kollagene von Typ 1 (Kol 1) und 5 (Kol 5) wurde analysiert. Das Expressionsprofil des antioxidativen Enzyms Superoxiddismutase 1 (SOD1) wurde aufgrund möglicher Veränderungen durch die Entstehung reaktiver Sauerstoffspezies nach einer Riboflavin-UV-A-Bestrahlung überprüft. Methoden: Keratozyten wurden aus gesunden und KC-Hornhäuten isoliert und in Basalmedium mit 5% fetalem Kälberserum kultiviert, was eine Transformation in Fibroblasten bewirkte. Die gesunden und KC-Zellkulturen wurden mit 0,01% (jeweils n=5) oder 0,1% (jeweils n=3) Riboflavin für 250 s mit UV-A-Licht bestrahlt. Das Expressionsprofil von NFkB, iNOS, IL-6, Kol 1, Kol 5 wurde mittels qPCR und Western Blot untersucht. Die IL-6-Konzentration im Zellkulturüberstand und im Zelllysat wurde mit einem ELISA gemessen. Die SOD1-Genexpressionsanalyse erfolgte mit einer qPCR. Ergebnisse: Die unbehandelten KC-HCF zeigten im Vergleich zu unbehandelten HCF eine erhöhte NFkB- (p=0,0002), eine erhöhte iNOS- (p=0,0019), sowie eine erniedrigte IL-6-(p=0,0057) mRNA-Genexpression. Zudem lag eine erhöhte Kol 1- (p=0,0286) und Kol 5- (p=0,0054) mRNA-Genexpression in unbehandelten KC-HCF vor. In der HCF-Gruppe führte eine 0,1%ige-Riboflavin-UV-A-Bestrahlung zum Anstieg der NFkB- (p=0,0286) und IL-6- (p=0,0057) mRNA-Genexpression. Die IL-6-Konzentration im Zellkulturüberstand wurde bei HCF (p=0,0485) und KC-HCF (p=0,0485) nach einer 0,1%igen-Riboflavin-UVA-Bestrahlung signifikant erhöht. Eine UV-A-Bestrahlung mit einer Riboflavin-Konzentration von 0,01% (p=0,0357) oder 0,1% (p=0,0357) führte lediglich bei KC-HCF zu einem signifikanten Anstieg der intrazellulären IL-6-Konzentration. In der HCF-Gruppe (p=0,0286) lag eine erhöhte Kol 1-mRNA-Genexpression nach einer 0,1%iger-Riboflavin-UV-A-Bestrahlung vor. Bei KC-HCF (p=0,0424) konnte ein signifikanter Anstieg der Kol 1-Proteinexpression nach einer 0,01%ige-Riboflavin-UV-A-Bestrahlung gemessen werden. Signifikante Veränderungen der SOD1-mRNA-Genexpression nach einer Riboflavin-UV-A-Bestrahlung wurden weder in der HCF- noch in der KC-HCF-Gruppe nach 24 h oder 48 h beobachtet. Auch zwischen unbehandelten HCF und KC-HCF lagen keine signifikanten SOD1-mRNA-Genexpressionsunterschiede vor. Schlussfolgerung: Die unbehandelten KC-HCF zeigten im Gegensatz zu unbehandelten HCF eine veränderte Expression inflammatorischer Marker, was für eine zugrundeliegende lokale inflammatorische Komponente bei KC sprechen könnte. Eine 0,1%ige-Riboflavin-UV-A-Bestrahlung führte sowohl bei HCF als auch bei KC-HCF zu einem signifikanten Anstieg der IL-6-Konzentration im Zellkulturüberstand. Zusätzlich konnte eine erhöhte intrazelluläre IL-6-Konzentration nach UV-A-Bestrahlung mit beiden Riboflavin-Konzentrationen (0,01% / 0,1%) lediglich bei KC-HCF gemessen werden, was darauf hindeutet, dass KC-HCF im Vergleich zu HCF diesen induzierten Stressreiz nur eingeschränkt kompensieren könnten. Eine erhöhte Kol 1- und Kol 5-Genexpression in KC-HCF ist möglicherweise ein Hinweis auf eine krankheitsbedingte Störung der Kollagensynthese bei KC. Die Kollagen-Quervernetzungen, die durch das Crosslinking entstehen, gehen vermutlich nicht mit einer bedeutenden Kollagen-Expressionsänderung einher. Auch der induzierte oxidative Stress im Rahmen einer Riboflavin-UV-A-Bestrahlung führte zu keinen signifikanten SOD1-Genexpressionsveränderungen. Somit zeigten KC-HCF im Vergleich zu HCF teilweise eine veränderte Reaktion auf die Riboflavin-UV-A-Bestrahlung, was möglicherweise durch vorbestehende pathologische metabolische Funktionen zu erklären ist.

Purpose: Crosslinking (CXL) is a minimally invasive treatment option to slow down the progression of keratoconus (KC). The simultaneous use of riboflavin as a photosensitizer and UV-A irradiation generated oxidative stress, resulting in crosslinking of the collagen fibrils in the corneal stroma. The aim of this work was to identify changes in gene and protein expression in human corneal fibroblasts (HCF) and keratoconus HCF (KC-HCF) before and after riboflavin UV-A irradiation. Expression changes of the inflammatory markers nuclear transcription factor kappa B (NFkB), inducible NO synthase (iNOS), and interleukin-6 (IL-6) were investigated and type 1 (Kol 1), and 5 (Kol 5) collagen expression was determined. In addition, the expression profile of the antioxidative enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1) has been examined for possible changes due to the formation of reactive oxygen species after riboflavin UV-A irradiation. Methods: Keratocytes were isolated from healthy and KC corneas and cultivated in basal medium with 5% fetal calf serum, which resulted in their transformation into fibroblasts. The healthy and KC cell cultures were irradiated with 0.01% (n=5) or 0.1% (n=3) riboflavin for 250 s with UV-A light. NFkB, iNOS, IL-6, Kol 1, Kol 5 were investigated by qPCR and Western blot analysis. IL-6 concentration in cell culture supernatant and cell lysate was determined by ELISA, and the SOD1 gene expression analysis was performed by qPCR. Results: Compared to untreated HCF, untreated KC-HCF showed increased NFkB (p=0.0002), increased iNOS (p=0.0019), and decreased IL-6 (p=0.0057) gene expression. In addition, there was an increased Kol 1 (p=0.0286) and Kol 5 (p=0.0054) mRNA gene expression in untreated KC-HCF. In the HCF group, 0.1% riboflavin UV-A irradiation led to an increase of NFkB (p=0.0286) and IL-6 (p=0.0057) gene expression. The IL-6 concentration in the cell culture supernatant was significantly increased in HCF (p=0.0485) and KC-HCF (p=0.0485) after 0.1% riboflavin UVA irradiation. A riboflavin concentration of 0.01% or 0.1% led to a significant increase of intracellular IL-6 concentration after UV-A irradiation only in KC-HCF (p=0.0357). In the HCF group (p=0.0286), there was an increased Kol 1 gene expression after 0.1% riboflavin UV-A irradiation. A significant increase in Kol 1 protein expression was measured in KC-HCF after 0.01% riboflavin UV-A irradiation (p=0.0424). Significant changes in SOD1 gene expression after riboflavin UV-A irradiation were not observed either in the HCF nor in the KC-HCF group after 24 h or 48 h, and there was also no significant difference in SOD1 gene expression between untreated HCF and KC-HCF. Conclusion: In contrast to untreated HCF, untreated KC-HCF showed an altered expression of inflammatory markers, which could indicate an underlying local inflammatory component in keratoconus. A 0.1% riboflavin UV-A irradiation led to a significant increase in IL-6 concentration in the cell culture supernatant in HCF and KC-HCF. In addition, an increased intracellular IL-6 concentration after UV-A irradiation with both riboflavin concentrations (0.01% / 0.1%) could only be measured in KC-HCF, indicating that KC-HCF, compared to HCF, could only compensate this induced stress stimulus to a limited extent. Increased Kol 1 and Kol 5 gene expression in KC-HCF may be an indication of a disease-related alteration of collagen synthesis in KC. The collagen crosslinking resulting from CLX is probably not associated with a substantial change in collagen expression. Also, the induced oxidative stress during riboflavin UV-A irradiation did not lead to significant SOD1 expression changes. Thus, KC-HCF showed a partially altered response to riboflavin UV-A irradiation compared to HCF, which may be explained by pre-existing pathological metabolic functions.