Molekularbiologische und zelltherapeutische Strategien zur Verbesserung der Vaskularisierung transplantierter Langerhans-Inseln

Abstract

Die Transplantation von Langerhans-Inseln als therapeutischer Ansatz für Typ I Diabetes-Patienten stellt eine vielversprechende Alternative zur täglichen Insulinapplikation dar. Da die transplantierten Langerhans-Inseln allerdings bisher unzureichend revaskularisiert werden und daher ihre endokrine Funktion und ihr Überleben oft nicht dauerhaft garantiert sind, konnte sich diese Therapiemethode bisher nicht in der klinischen Routine durchsetzen. Entsprechend wird bis heute an der Entwicklung neuer Ansätze geforscht, um die Vaskularisierung transplantierter Langerhans-Inseln zu verbessern. Nerve/glial antigen (NG) 2 ist ein Proteoglykan, welches von Perizyten exprimiert wird und an der Regulation der Angiogenese beteiligt ist. Der Einfluss von NG2 auf die Inseltransplantation ist jedoch bis heute nicht bekannt. Daher wurde im ersten Studienabschnitt der vorliegenden Arbeit untersucht, ob NG2 die Revaskularisierung transplantierter Inseln fördert. Dazu wurden die Langerhans-Inseln von NG2+/+-Wildtyp- und NG2-/--Knockout-Mäusen zunächst mittels Immunhistochemie auf ihre zelluläre Zusammensetzung untersucht. Anschließend konnte die endokrine Funktion der isolierten Inseln mittels eines Insulin-Enzym-Immunassays analysiert werden. Zuletzt wurden die NG2+/+- und NG2-/--Inseln auf den quergestreiften Hautmuskel der Rückenhautkammer von NG2+/+-Mäusen transplantiert, um deren Revaskularisierung mittels intravitaler Fluoreszenzmikroskopie sowie immunhistochemischen Methoden untersuchen zu können. Im Rahmen dieser Analysen konnte gezeigt werden, dass sich NG2+/+- und NG2-/--Langerhans-Inseln weder in ihrer zellulären Zusammensetzung noch in ihrer Insulin-Sekretion unterscheiden. NG2-/--Inseln wiesen jedoch im Vergleich zu NG2+/+-Kontrollen eine signifikant reduzierte funktionelle Gefäßdichte sowie eine verringerte Anzahl CD31-positiver Blutgefäße an Tag 10 nach Transplantation auf. Folglich konnte gezeigt werden, dass der Verlust von NG2 die Revaskularisierung transplantierter Langerhans-Inseln beeinträchtigt. Dies verdeutlicht die Bedeutung dieses perizytären Oberflächenproteins für die Inseltransplantation. Im zweiten Studienabschnitt der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob die Inkorporation von mikrovaskulären Fragmenten (MVF) in Inselorganoide deren Vaskularisierung verbessert. MVF werden aus Fettgewebe gewonnen und wurden bereits als potente Vaskularisierungseinheiten zur Prävaskularisierung von verschiedenen Geweben beschrieben. Bisher fanden sie allerdings noch keine Anwendung in der Inseltransplantation. Um prävaskularisierte Inselorganoide (PI+MVF) zu generieren, wurden Inselzellen und MVF aus C57BL/6N-Spendermäusen isoliert und über 5 Tage mithilfe der Liquid-Overlay-Technik co-kultiviert. Frisch isolierte Langerhans-Inseln, kultivierte Langerhans-Inseln und nicht prävaskularisierte Inselorganoide dienten als Kontrollen. Die Viabilität der Langerhans-Inseln und Inselorganoide wurde anhand von durchflusszytometrischen Analysen und der Verwendung von Spendermäusen, die einen endogenen Wasserstoffperoxid-Sensor exprimieren, bestimmt. Mithilfe von immunhistochemischen Untersuchungen und Western Blot-Analysen wurde die Interaktion zwischen den β- und Endothelzellen innerhalb der PI+MVF verifiziert. Die angiogene Aktivität der PI+MVF wurde in vivo unter Verwendung des murinen Rückenhautkammer-Modells und der repetitiven intravitalen Fluoreszenzmikroskopie sowie immunhistochemischer Methoden analysiert. Abschließend wurden PI+MVF in diabetische Empfängermäuse transplantiert, um die endokrine Funktion der Inselorganoide in vivo nachzuweisen. Im Rahmen dieser Analysen konnte gezeigt werden, dass die parakrine Signalübertragung zwischen β-Zellen und MVF die Viabilität und angiogene Aktivität der PI+MVF verbessert. In vivo wiesen die PI+MVF innerhalb der ersten Tage nach Transplantation eine beschleunigte Vaskularisierung auf, was anhand einer gesteigerten funktionellen Gefäßdichte und einem erhöhten Anteil an CD31-positiven Endothelzellen innerhalb der PI+MVF gezeigt werden konnte. Zudem induzierte die Transplantation von 250 Inselorganoiden in diabetische Mäuse innerhalb von 4 Tagen physiologische Blutglukosespiegel, während die identische Zahl frisch isolierter Langerhans-Inseln über den gesamten Beobachtungszeitraum von 28 Tagen nicht zu einer Normoglykämie führte. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Inkorporation von MVF die Vaskularisierung von PI+MVF deutlich verbessert und die Wiederherstellung einer Normoglykämie in diabetischen Mäusen beschleunigt. Der hier vorgestellte Prävaskularisierungsansatz könnte damit eine vielversprechende Strategie sein, um in Zukunft die Erfolgsraten der klinischen Inselzelltransplantation zu erhöhen.

Pancreatic islet transplantation is a promising therapeutic approach for the treatment of type 1 diabetic patients. However, this method is not yet established in clinical routine, because it is still limited by failed islet survival and endocrine function due to insufficient islet vascularization. To overcome this problem, current research focuses on strategies to improve the vascularization of transplanted islets. Nerve/glial antigen (NG) 2 is a proteoglycan, which is expressed on pericytes and a crucial regulator of angiogenesis. However, the influence of this proteoglycan on islet transplantation is still unknown. Accordingly, the aim of the first study section of the present thesis was to clarify whether NG2 promotes the revascularization of transplanted pancreatic islets. For this purpose, islets were isolated from NG2+/+ wild-type and NG2-/- knockout mice and analyzed by immunohistochemistry to examine their cellular composition. Their endocrine function was assessed by an insulin-enzyme-linked immunosorbent assay. Moreover, NG2+/+ and NG2-/- islets were transplanted into the dorsal skinfold chamber of NG2+/+ mice to study their revascularization by intravital fluorescence microscopy and immunohistochemistry. It could be shown that NG2+/+ and NG2-/- islets do neither differ in their cellular composition nor in their insulin secretion. However, NG2-/- islets exhibited a significantly reduced functional microvessel density and a lower number of CD31-positive blood vessels on day 10 after transplantation when compared to NG2+/+ controls. These results demonstrate that the loss of NG2 impairs the revascularization of transplanted islets, indicating the importance of this surface protein for successful islet transplantation. In the second study section of the present thesis, it was examined whether the incorporation of microvascular fragments (MVF) in islet organoids improves their vascularization after transplantation. MVF can be isolated from adipose tissue and have already been described as potent vascularization units for the prevascularization of various tissues. However, their impact on the engraftment of transplanted islets has not been analyzed, yet. For the generation of prevascularized islet organoids (PI+MVF), islet cells and MVF were isolated from C57BL/6N donor mice and co-cultured for 5 days by means of the liquid overlay technique. Freshly isolated islets, cultured islets and non-prevascularized islet organoids served as controls. The islets’ and islet organoids’ viability was determined by flow cytometric analysis and donor mice expressing an endogenous hydrogen peroxide sensor. Immunohistochemical studies and Western blot analysis were used to investigate the interaction between β-cells and endothelial cells within PI+MVF. The angiogenic potential of PI+MVF was determined by means of the mouse dorsal skinfold chamber model in combination with repetitive intravital fluorescence microscopy and immunohistochemical methods. Finally, PI+MVF were transplanted into diabetic recipient mice to verify their endocrine function in vivo. It could be shown that the paracrine signal transduction between β-cells and MVF improves the viability and angiogenic activity of PI+MVF. In vivo, PI+MVF exhibited an accelerated vascularization, as demonstrated by an increased functional microvessel density during the entire observation period and an increased fraction of endothelial cells 14 days after transplantation. Moreover, the transplantation of 250 PI+MVF into diabetic mice resulted in physiological blood glucose levels within 4 days, while the identical number of freshly isolated islets did not restore normoglycemia during the entire observation period of 28 days. Taken together, these results demonstrate that the incorporation of MVF significantly improves the vascularization of transplanted PI+MVF and accelerates the restoration of normoglycemia in diabetic mice. Thus, this prevascularization approach may be a promising strategy to increase the success of clinical islet cell transplantation in the future.