Functional Analysis of the Calcium-Dependent Activator Protein for Secretion 1 and 2 in Primary Mouse Dorsal Root Ganglion Neurons

Abstract

The calcium-dependent activator protein for secretion (CAPS) plays a central role in the secretion of neurotransmitters, neuropeptides, trophic factors or hormones in neurons and neuroendocrine cells. Two paralogs, CAPS1 and CAPS2, are expressed in mammals. Despite high sequence identity, they have redundant expression and function in neuroendocrine cells, but are almost mutually exclusive in neurons. In dorsal root ganglion (DRG) neurons, both paralogs are expressed. While CAPS1 is found in the majority of neurons, CAPS2 is expressed in a smaller population, the so-called peptidergic neurons. In the present work, a detailed analysis of the different subcellular localizations of CAPS1 and CAPS2 was carried out. Accordingly, the studies were designed on CAPS double knock out (dKO) DRG neurons that exogenously expressed either CAPS1- or CAPS2-HaloTag and were co cultured with spinal cord (SC) neurons. Live-cell staining of CAPS HaloTag was subsequently performed with the ATTO590 HaloTag ligand, which was visualized in confocal, 2D and 3D stimulated emission depletion (STED) microscopy. While CAPS2 accumulated in the soma of DRG neurons and showed a weak diffuse distribution in their neurites, CAPS1 was strongly enriched at synapses. More importantly, sequence analysis of CAPS paralogs detected a strong heterogeneity in the N terminus and revealed a unique CAPS1 domain of eleven amino acids in a putative coiled coil region that is not present in CAPS2. To investigate the function of this unique N terminal sequence in protein localization, a CAPS1/2 chimera was generated by introducing these 11 amino acids from CAPS1 into CAPS2. The direct comparison of the exogenous expression of CAPS1, CAPS2 and CAPS1/2 chimera revealed a function of this domain in protein localization, because the CAPS1/2 chimera had the same subcellular distribution as CAPS1. Based on the hypothesis that differential localization also leads to specific functions, the role of CAPS paralogs in the fusion of large dense core vesicles (LDCVs) and synaptic vesicles (SVs) was investigated. The analyses showed that LDCV fusion in DRG neurites can be mediated by either CAPS1 or CAPS2, whereas synaptic transmission is mainly promoted by CAPS1. Both the CAPS1/2 chimera and CAPS2 were not able to rescue synaptic transmission in CAPS dKO DRG neurons to the same extent as CAPS1. Thus, the unique N-terminal CAPS1 sequence does not appear to be involved in SV priming, although a role in the localization of the protein at synapses was shown. By immunoprecipitation and mass spectrometry, putative CAPS1 binding partners could be identified, which are involved in intracellular transport processes and thus might also play a role in the localization of the protein. Taken together, a new N-terminal sequence in CAPS1 was identified, which induces its specific subcellular localization at synapses. The understanding of the molecular mechanisms of transport and localization of synaptic proteins is of great interest to many scientists working on synaptic transmission and more generally on regulated exocytosis.

Das Protein Calcium-dependent activator protein for secretion (CAPS) spielt eine zentrale Rolle bei der Sekretion von Neurotransmittern, Neuropeptiden, trophischen Faktoren oder Hormonen in Neuronen und neuroendokrinen Zellen. Zwei Paraloge, CAPS1 und CAPS2, werden in Säugetieren exprimiert. Trotz hoher Sequenzidentität haben sie eine redundante Expression und Funktion in neuroendokrinen Zellen, schließen sich jedoch in Neuronen fast gegenseitig aus. In Neuronen des dorsalen Wurzelganglions (engl. Dorsal Root Ganglion, DRG) werden beide Paraloge exprimiert. Während CAPS1 in der Mehrheit der Neuronen vorkommt, wird CAPS2 in einer kleineren Population, den so genannten peptidergen Neuronen, exprimiert. In der vorliegenden Arbeit wurde eine detaillierte Analyse der unterschiedlichen subzellulären Lokalisationen von CAPS1 und CAPS2 durchgeführt. Die entsprechenden Studien wurden an CAPS Doppel Knockout (dKO) DRG Neuronen konzipiert, die exogen entweder CAPS1- oder CAPS2-HaloTag exprimierten und mit Neuronen des Rückenmarks (engl. spinal cord, SC) ko kultiviert wurden. Die Lebendzellfärbung von CAPS HaloTag wurde anschließend mit dem ATTO590 HaloTag Liganden durchgeführt, der in konfokaler, 2D- und 3D-Stimulated Emission Depletion (STED)-Mikroskopie visualisiert wurde. Während CAPS2 sich im Soma von DRG Neuronen anreichert und eine schwach diffuse Verteilung in deren Neuriten zeigt, ist CAPS1 an den Synapsen stark angereichert. Darüber hinaus wurde durch eine Sequenzanalyse der CAPS Paraloge eine Heterogenität im N Terminus identifiziert, die auf eine einzigartige CAPS1 Domäne von elf Aminosäuren in einer mutmaßlichen Coiled-coil-Region hinweist, die in CAPS2 nicht vorhanden ist. Um die Funktion dieser einzigartigen N-terminalen Sequenz bei der Proteinlokalisierung zu untersuchen, wurde eine CAPS1/2-Chimäre erzeugt, indem die spezifischen 11 Aminosäuren von CAPS1 in CAPS2 eingeführt wurden. Interessanterweise wurde bei einem direkten Vergleich der exogenen Expression von CAPS1, CAPS2 und der CAPS1/2-Chimäre eine potentielle Funktion dieser Domäne bei der Proteinlokalisierung bestätigt, da die CAPS1/2-Chimäre die gleiche subzelluläre Verteilung wie CAPS1 aufwies. Basierend auf der Hypothese, dass eine differentielle Lokalisation auch zu spezifischen Funktionen führt, wurde die Rolle der CAPS Paraloge bei der Fusion von elektronendichten Granula (engl. Large Dense Core Vesicle, LDCV) und synaptischen Vesikeln (SV) untersucht. Die Analysen zeigten, dass die LDCV Fusion in DRG Neuriten in gleichermaßen von CAPS1 oder CAPS2 vermittelt werden kann, wohingegen die synaptische Übertragung hauptsächlich durch CAPS1 gefördert wird. Sowohl die CAPS1/2-Chimäre als auch CAPS2 waren nicht in der Lage, die reduzierte synaptische Übertragung in CAPS dKO DRG-Neuronen im gleichen Maße zu erhöhen wie CAPS1. Eine Funktion der spezifischen N-terminalen CAPS1 Sequenz bei der synaptischen Übertragung konnte somit nicht beobachtet werden, obwohl eine Rolle bei der Lokalisierung des Proteins an Synapsen gezeigt wurde. Durch Immunpräzipitation und Massenspektrometrie konnten mutmaßliche CAPS1 Bindungspartner identifiziert werden, die unter anderem an intrazellulären Transportprozessen beteiligt sind und somit auch eine Rolle bei der Lokalisation des Proteins spielen könnten. Zusammengenommen wurde eine neue N-terminale Sequenz in CAPS1 identifiziert, die dessen spezifische subzelluläre Lokalisation an Synapsen induziert. Die Aufklärung der molekularen Mechanismen des Transports und der Lokalisierung synaptischer Proteine ist für viele Wissenschaftler von großem Interesse, die sich mit der synaptischen Übertragung und ganz allgemein mit der regulierten Exozytose befassen.