Vascular Endothelial Growth Factor-beschichtete Mineral Coated Microparticles verbessern die Knochenheilung atropher Pseudarthrosen im Mausmodell

Abstract

Vascular Endothelial Growth Factor-beschichtete Mineral Coated Microparticles verbessern die Knochenheilung in atrophen Pseudarthrosen Fragestellung. Pseudarthrosen sind das Ergebnis insuffizienter Heilung frakturierter Knochen. Hypertrophen Pseudarthrosen liegt häufig eine mangelnde Stabilität des Frakturspaltes zugrunde, wohingegen atrophe Pseudarthrosen meist durch eine gestörte Blutversorgung mit konsekutiver Störung der Osteogenese verursacht werden. Während hypertrophe Pseudarthrosen durch eine adäquate Stabilisierung erfolgreich behandelt werden können, besteht die Therapie atropher Pseudarthrosen hingegen in einer Verbesserung der Angiogenese und Osteogenese. Dem Wachstumsfaktor Vascular endothelial growth factor (VEGF) konnten in der Vergangenheit wichtige Einflüsse auf Angiogenese und Zellproliferation während der frühen Phase der Knochenheilung nachgewiesen werden. Um VEGF mit räumlicher und zeitlicher Kontrolle innerhalb des Frakturspalts zu applizieren, bedarf es eines fortschrittlichen Trägermaterials wie z. B. Mineral Coated Microparticles (MCM). Folglich war das Ziel dieser Studie, zu untersuchen, ob VEGF-beschichtete MCM die Knochenheilung atropher Pseudarthrosen verbessern. Methoden. Zunächst wurde die Bindungs- und Freisetzungskinetik von MCM für VEGF über einen Zeitraum von 50 Tagen in vitro untersucht. Hiernach wurden VEGF-beschichtete MCM oder unbeschichtete MCM lokal in einem standardisierten Pseudarthrosemodell in Femora von CD-1 Mäusen in vivo appliziert. MCM-freie Pseudarthrosen dienten als Kontrolle. Die Untersuchungszeit je Gruppe betrug in vivo 14 und 70 Tage. Konsekutiv wurden die Knochen explantiert und der Osteotomiespalt radiologisch durch Röntgenaufnahmen und mithilfe einer Mikocomputertomographie (μCT), biomechanisch, histomorphometrisch, immunhistoche- misch und mittels Western Blot (WB) analysiert. Ergebnisse. Die Bindungseffizienz von MCM für VEGF betrug 46 ± 3 %. Das Freisetzungsprofil zeigte initial eine hohe Freisetzung, gefolgt von einer verzögerten Freisetzung über den restlichen Untersuchungszeitraum. Hierdurch wurde das physiologische Expressionsprofil von VEGF während der Knochenheilung nachgeahmt. In vivo zeigten Knochendefekte, welche mit VEGF-beladenen MCM behandelt wurden, im Vergleich zu Knochendefekten der anderen Gruppen, einen höheren Anteil Knochenvolumen am Gesamtgewebevolumen, eine erhöhte Biegesteifigkeit und eine größere Kallusfläche 14 und 70 Tage postoperativ. WB- Analysen von Kallusgewebe, das mit VEGF-beladenen MCM behandelt wurde, zeigte 14 Tage postoperativ im Vergleich zu Kallusgewebe der anderen Gruppen eine höhere Expression von VEGF, Erythropoetin (EPO) sowie des Transkriptionsfaktors runt-related transcription factor (RUNX-2), nicht jedoch von EPO-Rezeptor (EPO-R). Schlussfolgerungen. Die vorliegende Studie zeigt die erste Anwendung von MCM als Trägersubstanz zur therapeutischen Applikation von VEGF in Pseudarthrosen. Die Ergebnisse bestätigen die Hypothese, dass VEGF-beschichtete MCM die Knochenheilung in einem etablierten atrophen Pseudarthrosemodell in Mäusen verbessern. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, dass die Verwendung von MCM zur Applikation von VEGF aufgrund der Fähigkeit die Proteinstabilität und -funktionalität in vivo zu erhalten ein großes Potenzial aufweist. Daher stellt die Anwendung VEGF-beladener MCM einen vielversprechenden Ansatz zur Behandlung atropher Pseudarthrosen dar.

VEGF-loaded mineral coated microparticles improve bone repair in atrophic non- unions Background and purpose. Non-unions are the result of insufficient healing of fractured bones. Hypertrophic non-unions are often based on a lack of stability of the fracture gap, whereas in atrophic non-unions a poor vascular supply and, thus, an impaired osteogenesis of the fracture gap are known to be the key factors for insufficient healing. While hypertrophic non-unions can be treated successfully by adequate stabilization of the fracture, the therapeutic approaches of atrophic non-union comprise mainly an improvement of angiogenesis and osteogenesis. In the past, vascular endothelial growth factor (VEGF) has been shown to have a number of important influences on angiogenesis and cell proliferation during the early course of bone regeneration. In order to apply VEGF with spatiotemporal control within the fracture gap, a sophisticated carrier system such as mineral coated microparticles (MCM) is necessary. Hence, the aim of the present study was to investigate whether VEGF-loaded MCM improve bone repair in atrophic non-unions. Methods. First, binding and release kinetics of MCM for VEGF were analyzed over a period of 50 days in vitro. Thereafter, VEGF-loaded or unloaded MCM were locally applied to a standardized non-union model in femurs of CD-1 mice in vivo. MCM-free non-unions served as controls. The observation period in vivo per group was 14 and 70 days. Subsequently, the bone was explanted and the osteotomy gap was examined by means of radiological as X-ray and microcomputer tomography, biomechanical, histomorphometric, immunohistochemical and western blot (WB) techniques. Results. The binding efficiency of MCM for VEGF was 46 ± 3 % and the release profile revealed an initial minor burst release, followed by a sustained release over the study period, thus, mimicking the physiological expression profile of VEGF during bone healing. In vivo, bone defects treated with VEGF-loaded MCM exhibited a higher fraction of bone volume / tissue volume radiologically, an increased bending stiffness and a larger callus area 14 and 70 days after osteotomy compared to bone defects of the other groups. WB analyses 14 days after surgery of callus tissue treated with VEGF-loaded MCM revealed a higher expression of VEGF, erythropoietin (EPO) and runt-related transcription factor 2 (RUNX-2), but not of EPO-receptor (EPO-R) compared to callus tissue of the other groups. Conclusions. The present study is the first demonstration to use MCM as carriers for therapeutic VEGF delivery in non-unions. Our results confirm the hypothesis that VEGF-loaded MCM are capable of improving bone repair in a well established atrophic non-union model in mice. The results of the present study further demonstrate that the use of MCM for VEGF delivery shows great potential due to the ability to maintain protein stability and functionality in vivo. Thus, the application of VEGF-loaded MCM represent a promising strategy for the treatment of atrophic non-unions.