Expression von Immunrezeptoren in Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereiches in Abhängigkeit des 25-OH-Vitamin-D-Serumspiegels und des HPV-Status

Abstract

Als sechst häufigste Tumorentität weltweit zählen Plattenepithelkarzinome des Kopf-Hals- Bereiches zu den Tumorerkrankungen mit schlechten prognostischen Aussichten: Die 5-Jahres- Überlebensrate von lediglich 50%-60% konnte in den vergangenen Jahren trotz neuer Therapieansätze nur unwesentlich verbessert werden, was zum Einen ursächlich auf die enorme Variabilität im Therapieansprechen multimodaler Behandlungsverfahren, den daraus resultierenden funktionellen und ästhetischen Defiziten sowie den damit einhergehenden Nebenwirkungen zurückzuführen ist. Zum Anderen erfolgt bei der Mehrzahl der Fälle eine sehr späte Diagnosestellung, welche einschränkende Auswirkungen auf die Wahl der Therapiemaßnahmen hat und die Identifikation des Tumorentstehungsortes oft erschweren kann. Kopf-Hals-Tumoren sind gekennzeichnet durch eine komplexe mutationslastige Tumormikroumgebung, welche zum Teil für das limitierte Ansprechen zielgerichteter medikamentöser Therapien verantwortlich sein könnte. Aus diesem Grund besteht eine Notwendigkeit, neue Biomarker aufzudecken, die eine Früherkennung der Karzinome erleichtern, eine verbesserte Prognose-einschätzung erlauben und für den individuellen Patientenfall effektive Therapieoptionen ermöglichen. Mit Vitamin-D, einem Hormon mit vielfältigen physiologischen Effekten auf zahlreiche Organ-systeme, werden multiple immunstimulierende Eigenschaften und eine gewisse antitumorale Potenz assoziiert, die über zelluläre und humorale Mechanismen moduliert wird. Dazu kommt, dass die Mehrzahl der an einem Kopf-Hals-Tumor erkrankten Patienten einen ausgeprägten Vitamin-D-Mangel aufweisen und diese Tumorentität in der Regel mit immunsuppressiven Eigenschaften einhergeht. In dieser Arbeit wurde demnach der Frage nachgegangen, ob der Vitamin-D-Status von Kopf-Hals-Tumorpatienten eine Auswirkung auf molekulare Interaktionen zwischen Tumorzellen und dem Immunsytem haben und die dadurch vermittelte Immunsuppression einschränken könnte. Von dieser Grundüberlegung ausgehend wurden Tumorgewebeproben von 112 Kopf-Hals- Karzinompatienten auf das Expressionsverhalten der Immun-Checkpoint-Moleküle CD80, B7-H3, B7-H4 sowie PD-L1 und dem zellulären Oberflächenproteinkomplex MHC1 immunhistochemisch analysiert. Das Patientenkollektiv gliederte sich dabei in Abhängigkeit vom 25-OH-Vitamin-D- Serumspiegel in eine Patientengruppen bestehend aus 61 Patienten mit einem Vitamin-D-Mangel (25- OH-Vitamin-D < 10 ng/ml) sowie 52 Patienten mit ausreichender Vitamin-D-Versorgung (25-OH- Vitamin-D > 10 ng/ml). Die immunhistochemischen Färbungen wurden semiquantitativ mit Hilfe eines immunreaktiven Scores ausgewertet. Zusätzlich wurde die Expression der oben genannten Moleküle in kultivierten Kopf-Hals-Tumorzellen der FaDu-Zelllinie mittels SDS-Gelelektrophorese und Western Blot als Grundlage für weiterführende funktionelle Untersuchungen analysiert. Die Färbungen bestätigten eine positive Korrelation zwischen einem ausreichend hohen Vitamin-D- Serumspiegel bei Kopf-Hals-Tumorpatienten und einer verstärkten Expression stimulierender Immun- Checkpoint-Moleküle auf den Tumorzellen im Sinne eines immunstimulativen, antitumoralen Einfluss des Vitamin-D: Bei ausreichender Vitamin-D-Versorgung zeigte sich zum einen eine vermehrte tumorale Expression der immunstimulierenden Marker CD80 (p = 0,0707) und MHC1 (p = 0,0190) und zum anderen eine gesteigerte peritumoral-leukozytäre CD80-Expression (p = 0,0324). Eine vermehrte tumorale MHC1-Expression korrelierte zudem positiv mit dem HPV-Status (p = 0,0053) und ging mit einem verlängerten Gesamtüberleben einher (p = 0,0325). Das immunzellinhibierende Immun-Checkpoint-Molekül B7-H4 war auf Tumoren von Patienten mit einem Vitamin-D-Mangel (p = 0,0705) und bei HPV-negativen Tumoren (p = 0,1332) unabhängig vom Vitamin-D-Status vermehrt exprimiert, sodass dieses Resulat übereinstimmend mit den dargestellten Ergebnissen der immunzell- aktivierenden Moleküle auf eine geförderte antitumorale Aktivität des menschlichen Immunsystems bei Kopf-Hals-Tumorpatienten durch Vitamin-D hindeutet sowie im Einklang mit der Tatsache steht, dass HPV-negative Kopf-Hals-Tumoren starke immunsuppressive Eigenschaften aufweisen. B7-H3, welches sowohl immunstimulierende Effekte als auch immunsupprimierende Funktionen ausüben kann, war bei Patienten mit ausreichender Vitamin-D-Versorgung auf Tumorzellen klar überexprimiert (p = 0,0052) und ging mit einem signifikanten Überlebensvorteil einher (p = 0,0037). Dies könnte damit zusammenhängen, dass bei ausreichender Vitamin-D-Versorgung durch gesteigerte Immunzell- infiltration und geringere immunsuppressive Prozesse in der Tumormikroumgebung möglicherweise eher die co-stimulatorischen Effekte überwiegen. Bei Betrachtung der tumoralen (p = 0,4730) und leukozytären (p = 0,4032) PD-L1-Expression, konnte kein Zusammenhang zwischen der Höhe des Vitamin-D-Serumspiegels und dem Expressionsverhalten nachgewiesen werden. Jedoch korrelierte der HPV-Status positiv mit der PD-L1-Tumorexpression (p = 0,0784), was durch die hohen IFN-γ- Spiegel im Rahmen der antitumoralen immunologischen Aktivität bedingt sein könnte. Eine vermehrte PD-L1-Expression auf Tumorzellen war insbesondere bei Tumorpatienten mit ausreichender Vitamin- D-Versorgung mit schlechten prognostischen Aussichten verbunden (p = 0,0613). Im vorliegenden Patientenkollektiv führte eine ausreichende Vitamin-D-Versorgung in Relation zu Patienten mit einem Vitamin-D-Mangel zu einem signifikant verlängerten Gesamtüberleben von durchschnittlich 10 Monaten (p = 0,0288). In der Western Blot-Analyse der Immun-Checkpoint-Molekül-Expression in FaDu-Zellen konnte lediglich für PD-L1 ein Signal nachgewiesen werden. Die in der vorliegenden Arbeit erhobenen Ergebnisse demonstrieren, dass eine ausreichende Vitamin- D-Versorgung gerade in der Kopf-Hals-Onkologie von hoher prognostischer und therapeutischer Relevanz sein kann, da überwiegend immunsuppressive Signalwege in der Tumormikroumgebung durch eine ausreichende Vitamin-D-Versorgung und einen positiven HPV-Status verhältnismäßig eingeschränkt werden, sodass eine effektive Anti-Tumor-Immunantwort generiert werden kann und tumorprogressions-fördernde Eigenschaften reduziert werden. Diese Daten liefern Anhaltspunkte dafür, dass neben einer fokussierten Betrachtung der immunologischen Organisation in Kopf-Hals- Tumoren funktionell-immunologische Veränderungen im Zusammenhang mit dem Vitamin-D-Status weiter untersucht werden sollten mit der Zielsetzung durch Vitamin-D induzierte Veränderungen in der zellulären und humoralen Komposition der Tumormikroumgebung zu identifizieren. Aktuell sind in vitro-Experimente an HNSCC-Zelllinien, die mit aktivem Vitamin-D in sowohl supraphysiologischen als auch physiologischen Konzentrationen behandelt werden in Planung. Letzlich könnte eine ergänzende Vitamin-D-Substitution bei Kopf-Hals-Tumor-Patienten im Zuge eines multimodalen Therapiekonzeptes die prognostische Perspektive sowie die Effektivität einer Immuntherapie verbessern.

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is the sixt most common cancer globally with 5- year-survival-rates as low as 50%–60%, thus indicating poor prognosis. However the approval of few novel therapeutic modalities in recent years has not substantially improved prognosis for head and neck cancer patients, due to several reasons: First of all, treatment can be quite morbid whilst creating side effects and resulting in significant functional as well as aesthetic deficits. Secondly, late stage diagnosis often limits therapeutical approaches and impedes the identification of the exact tumor location. Additionally, the complex mutational landscape in head and neck cancer may account for insufficient response of targeted therapies, since most tumors evolve under treatment-associated selective pressures and possess various genetic drivers of oncogenesis. For this reason, it remains necessary to identify new prognostic and predictive biomarkers, which facilitate an early detection of cancer and enable novel therapeutic strategies. The physiologically active hormone Vitamin-D is linked with modulatory functions on the human immune system and favors antitumor immunity by initiating cellular and humoral effects. Moreover, the vast majority of patients suffering from head and neck cancer display a considerable Vitamin-D deficiency and this tumor entity is often associated with a predominantly immune suppressive landscape. Tumor tissue samples from 112 HNSCC patients, of which 51 had adequate serum levels of Vitamin-D (25-OH-Vitamin-D > 10 ng/ml) while 61 exhibited a Vitamin-D deficiency (25-OH-Vitamin-D < 10 ng/ml), were subjected to conventional immunohistochemistry in order to assess the influence of Vitamin-D on the immunological crosstalk between tumor and immune cells. To address this, the expression of immunoregulative proteins MHC1, B7-H4, B7-H3, PD-L1 and CD80 was analyzed. Additionally, the expression of the same molecules was studied on FaDu-cells, an immortalized HNSCC cell line, by performing a SDS-gel-electrophoresis and western blot. The evaluation of the immunohistochemical stainings with a semiquantitative immunoreactivity score demonstrated that an adequate Vitamin-D status was associated with a higher tumoral expression of CD80 (p = 0,0707) and MHC1 (p = 0,0190), thus confirming the immune stimulatory and antitumorigenic influence of Vitamin-D. Peritumoral leukocytes expressed more CD80 among patients with higher Vitamin-D levels (p = 0,0324). Higher tumor levels of MHC1 correlated positively with a positive HPV-Status (p = 0,0053) and an improved overall survival (p = 0,0325). In conformity with these results, an increased B7-H4 tumor expression was observed among patients with Vitamin-D deficiency (p = 0,0705) and negative HPV-Status (p = 0,1332), which might be explained through the predominantly immune suppressive tumor landscape among these patients, as B7-H4 is considered immune inhibitory. B7-H3, which is thought to serve as both a co-inhibitor and co-stimulator of T-cell 3 Zusammenfassung/Summary responses, was clearly overexpressed in tumor tissue from patients with adequate Vitamin-D serum levels (p = 0,0052) and correlated with an improved overall survival among these patients (p = 0,0037), implying that the altered tumor microenvironment in patients with sufficient Vitamin-D supply may promote co-stimulatory interactions. No considerable influence was detectable for the expression of PD-L1 on both tumor (p = 0,4730) and leukocytes (p = 0,4032). However, a positive HPV-status was associated with a high PD-L1 expression on tumor tissue (p = 0,0784), which may have occurred due to high IFN-γ-levels in the context of a strong antitumorigenic immune activity in HPV-positive tumors. High tumoral PD-L1 expression among patients with elevated Vitamin-D serum levels was linked with poor prognostic outcome (p = 0,0613). In accordance with all these findings, an adequate Vitamin-D status significantly correlated with an improved overall survival among head and neck cancer patients (p = 0,0288), as these patients lived 10 months longer on average compared to patients with Vitamin-D deficiency. Merely a signal associated with PD-L1 expression was observed through western blot analysis in cultured FaDu cells with no significant expression of all other immune checkpoint molecules. In summary, the obtained results clearly emphasize the prognostic and therapeutic relevance of an adequate Vitamin-D supply for patients suffering from head and neck squamous cell carcinoma, by revealing that normal Vitamin-D blood levels and a positive HPV-status limit immunosuppressive interactions within the tumor microenvironment, which in turn leads to more potent antitumorigenic immune responses and impaired tumor progression. These results provide an informative basis for a specific examination of the immunological landscape in head and neck cancer, which should aim at identifying potentially through Vitamin-D inducible alterations considering cellular and humoral elements in the tumor microenvironment. Ongoing in vitro-experiments with HNSCC-cell lines, treated with supraphysiological and physiological concentrations of active Vitamin-D are further addressing these issues. Ultimately, supplying HNSCC-patients with Vitamin-D may support antitumorigenic immune responses in an immunotherapeutic setting as part of a multimodal therapy whilst simultaneously contributing to the improvement of the patients’ prognosis.