Reparaturfoci als Biomarker für Strahlenempfindlichkeit und chronische Strahlenexposition

Abstract

Die Etablierung von Biomarkern zur Vorhersage und Erfassung der individuellen Strahlenreaktion spielt vor dem Hintergrund der Zunahme der zivilisatorischen Strahlenexposition eine entscheidende Rolle im personalisierten Strahlenschutz. Das Ziel dieses Forschungsprojektes war es, ein Hochdurchsatzverfahren zur semi-automatischen Analyse von strahlen-induzierten Reparaturfoci Proteinen der DNA Schadensantwort zu etablieren und diese als potenzielle Biomarker zur Vorhersage einer Strahlenempfindlichkeit und zum Nachweis einer zurückliegenden, chronischen Strahlenexposition zu validieren. Ausgangspunkt der Untersuchungen war dabei zum einen die Visualisierung und Quantifizierung von γH2A.X und weiteren Signalisierungs- und Reparaturproteinen der DNA Schadensantwort mittels Immunfluoreszenzfärbung, welche in der Strahlenbiologie zum Nachweis von DNA Doppelstrangbrüchen nach Exposition mit ionisierender Strahlung Anwendung findet. Zum anderen kann die Analyse von Chromosomenschäden Rückschlüsse auf die Qualität der DNA Schadensantwort liefern. Im Verlauf des Projektes wurde zunächst eine semi-automatische Quantifizierung von γH2A.X Foci und Analyse von Chromosomenaberrationen nach in vitro Bestrahlung primärer Lymphozyten von acht Patienten mit Ataxia teleangiectatica durchgeführt, um festzustellen, ob diese Testverfahren und Biomarker zum Nachweis einer ausgeprägten, genetisch-bedingten Strahlenempfindlichkeit geeignet sind. Dabei zeigte die Foci Analyse individuelle Variationen in der Signalisierung und Reparatur der DNA Doppelstrangbrüche zwischen den einzelnen Patienten, sodass ein Nachweis der Strahlenempfindlichkeit nicht für alle Patienten möglich war. Im Gegensatz dazu erlaubte die Analyse von Chromosomenschäden den eindeutigen Nachweis der Strahlenempfindlichkeit anhand von erhöhten Aberrationsraten und einer starken Schädigung der Zellen. Unterschiede in der DNA Schadensantwort zwischen einzelnen Individuen erfordern eine genauere Charakterisierung in großen Untersuchungskollektiven. In solchen molekular-epidemiologischen Studien ist durch das komplexe Versuchsdesign die Sammlung, Lagerung und zeitversetzte Untersuchung von biologischen Proben notwendig. Im Projekt wurde daher eine semi-automatische Reparaturfoci-Analyse für γH2A.X, 53BP1, MDC1 und pKAP1 in kryokonservierten Lymphozyten etabliert. In den fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen wurde die Signalisierung und Reparatur von DNA Doppelstrangbrüchen mithilfe einer Dosis-Effekt-Kurve und Zeitkinetik nachgewiesen. Während für γH2A.X und 53BP1 keine signifikanten Unterschiede zwischen kryokonservierten und frisch isolierten Lymphozyten beobachtet wurden, konnten für pKAP1 quantitative Unterschiede nach Bestrahlung festgestellt werden. Trotz semi-automatischer Testverfahren erreichen Labore bei einer hohen Probenanzahl schnell ihre Kapazitätsgrenze. Im Weiteren wurde daher die Einbindung von ungeübten Mitarbeitern in die Reparaturfoci-Analyse geprüft. Die Untersuchungen konnten zeigen, dass sowohl bei der praktischen Durchführung der Immunfluoreszenzfärbung als auch bei der manuellen Foci-Zählung der Probendurchsatz durch ungeübte Mitarbeiter erhöht werden kann. Um zu überprüfen, ob die etablierte, semi-automatische Reparaturfoci-Analyse schließlich in molekular-epidemiologischen Studien eingesetzt werden kann und damit der Nachweis einer vergangenen, chronischen Strahlenexposition möglich ist, wurde die Anzahl der Foci von γH2A.X, 53BP1 und pKAP1 nach in vitro Bestrahlung in kryokonservierten Lymphozyten von 106 ehemaligen Uranb Bergarbeitern bestimmt. Dabei wurde mittels Foci Quantifizierung der Effekt einer in vitro Bestrahlung in den Proben der Bergarbeiter gezeigt. Hingegen konnte eine lang zurückliegende, chronische Strahlenbelastung oder der Einfluss der Expositionshöhe aufgrund von interindividuellen und interexperimentellen Variationen nicht eindeutig nachgewiesen werden. Die Untersuchungen von Chromosomenschäden deuten jedoch auf einen Einfluss der Expositionshöhe auf die Anzahl der geschädigten Zellen und komplexen Aberrationen hin. Zusammenfassend ermöglicht die etablierte, semi-automatische Reparaturfoci-Analyse die Untersuchung der Signalisierung und Reparatur von DNA Doppelstrangbrüchen in kryokonservierten Lymphozyten. Die erhaltenen Ergebnisse sind durch die hohe interindividuelle und interexperimentelle Variation beeinflusst, wodurch die Nutzung als Biomarker zum eindeutigen Nachweis einer genetisch-bedingten Strahlenempfindlichkeit oder vergangenen, chronischen Strahlenexposition in den hier durchgeführten Untersuchungen nicht ohne weiteres möglich war. Im Gegensatz dazu erlaubte die Analyse von Chromosomenschäden die Identifikation einer genetisch-bedingten Strahlenempfindlichkeit und gab Hinweise auf eine chronische Strahlenbelastung. Diese Untersuchungsmethoden sind jedoch meist teuer, zeit- und arbeitsaufwändig und daher nicht als Routineanalyse für eine hohe Probenanzahl geeignet. Zur Erforschung von Ursachen und Einflussfaktoren der individuellen Strahlenempfindlichkeit ist jedoch die Untersuchung von großen Untersuchungskollektiven mit einer Kombination verschiedener Testverfahren nötig. Die Reparaturfoci-Analyse bietet das Potenzial als Hochdurchsatzverfahren einen wichtigen Bestandteil in zukünftigen molekular-epidemiologischen Studien der strahlenbiologischen Forschung darzustellen.

Reliable biomarkers detecting and predicting individual adverse effects of ionizing radiation exposure are urgently warranted to implement precautionary radiation protection measures due to an increase in man-made radiation exposure. Visualization and quantification of DNA damage response proteins enables the detection of radiation-induced DNA double-strand breaks and the investigation of DNA damage signaling and –repair. In addition, analysis of number and type of chromosomal aberrations provide an indication of the quality of repair processes. Therefore, the aim of this study was to establish a high-throughput quantification of radiation-induced foci by semi-automatic immunofluorescence microscopy and to validate them as potential biomarker to predict radiation sensitivity and to detect chronic exposure to ionizing radiation. First, lymphocytes of eight Ataxia-telangiectasia (AT) patients and ten healthy controls were in vitro irradiated and induced DNA damage, DNA repair capacity and quality of DNA repair were analyzed to validate the prediction of genetically determined radiation sensitivity by these biomarkers. DNA damage induction and DNA repair as detected by phosphorylated H2A.X revealed individual differences and were heterogeneous among AT patients. Phosphorylation of H2A.X seems to depend on the underlying individual mutation and thus appears not well suited as a biomarker for general radiation sensitivity in AT patients. By contrast, background and radiation-induced chromosomal aberrations were significantly elevated in AT patients and AT cells demonstrated multiple damaged sites. Using mFISH analysis, chromosomal breakage was confirmed as a reliable biomarker for radiation sensitivity in AT patients. Detection of individual differences in DNA damage repair processes requires extended investigations in large study groups. However, the complex study design of molecular-epidemiological studies demands the collection, storage and time-displaced screening of biological samples. On the basis of these facts, a high-throughput quantification of γH2A.X, 53BP1, MDC1 and pKAP1 was established in cryopreserved lymphocytes by semi-automatic immunofluorescence microscopy. DNA damage signaling and DNA repair were evaluated by generating dose-response curves and time kinetics. No significant differences were noticed for γH2A.X and 53BP1 between cryopreserved and freshly isolated lymphocytes. However, slightly higher foci numbers were observed in cryopreserved lymphocytes. In addition, significant higher values for pKAP1 quantification were observed in cryopreserved lymphocytes in comparison to freshly isolated lymphocytes.

Despite the use of high-throughput methods like γH2A.X foci assay, most laboratories will quickly reach their capacity limit in large-scale studies. Thus, inclusion of inexperienced operators in the radiation-induced foci assay was evaluated to speed up sample flow rate and increase laboratory capacity. The results suggested that inexperienced operators could support slide preparation as well as foci quantification. To verify subsequently the potential use of the established semi-automatic foci quantification in molecular-epidemiological studies and to detect chronic radiation exposure, the number of γH2A.X, 53BP1 and pKAP1 foci were analyzed in cryopreserved lymphocytes of 106 retired uranium miners after in vitro irradiation. Thereby, the dose- and time-depended effect in foci formation was determined before and after in vitro irradiation. However, no clear evidence for chronic radiation exposure or an influence of the level of exposure were noticed due to inter-individual and inter-experimental variations. Nevertheless, analysis of chromosomal aberrations indicates an exposure-dependent increase in the number of damaged cells and complex aberrations. In conclusion, the established semi-automatic quantification of radiation-induced foci enables a high-throughput evaluation of signaling and repair of DNA double-strand breaks in cryopreserved lymphocytes. This study identified that microscopic radiation-induced foci analysis is influenced by inter-individual and inter-experimental differences and is less effective for identifying radiation sensitivity or chronic radiation exposure than the mFISH assay for chromosomal aberrations. Nevertheless, mFISH analysis is time-consuming, labor-intensive and expensive, so this technique is not suitable as a rapid screening assay in routine analysis. A promising future strategy might be the screening of large study groups and the combination of several fast, cost-effective measurable and easy accessible biological markers in blood samples for a reliable prediction and clarification of causes and influencing factors of individual radiation sensitivity. High-throughput analysis of radiation-induced foci should be an inherent part in future molecular-epidemiologic studies in the research field of radiation biology.